Deteksi Kualitatif Cronobacter spp. Menggunakan PCR Simpleks.

Abstract

Cronobacter spp adalah patogen bawaan pangan oportunistik yang telah dikaitkan dengan kasus meningitis, necrotizing enterocolitis dan bacteremia pada bayi kelompok tertentu melalui susu formula yang tercemar. Keberadaan Cronobacter spp dalam pangan umumnya dideteksi secara kultur konvensional dan uji biokimia. Deteksi tersebut memerlukan waktu lama dan media khusus yang relatif mahal, oleh karena itu, metode deteksi yang lebih cepat banyak dikembangkan. Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan metode Polymerase Chain Reaction (PCR) simpleks untuk mendeteksi Cronobacter spp. dengan target gen yang diharapkan cukup spesifik yaitu hfq, ompA dan grxB. DNA C. sakazakii diisolasi dengan metode Chelex 100, diamplifikasi dengan satu dari tiga primer untuk target gen hfq, ompA dan grxB yang berturut-turut menghasilkan amplikon dengan ukuran 309 bp, 1099 bp dan 378 bp. Spesifisitas yang baik dihasilkan oleh primer HFQ yang mengamplifikasi gen hfq dan primer CGB untuk target gen grxB. Primer HFQ dan CGB hanya mengamplifikasi DNA dari Cronobacter sakazakii dan tidak mengamplifikasi non-Cronobacter. Optimasi kondisi running PCR dilakukan dengan memvariasikan suhu annealing pada 50 °C dan 52 °C untuk HFQ; 52 °C, 55 °C dan 57 °C untuk CGB dan konsentrasi primer 0.5 μM, 0.3 μM dan 0.1 μM. Kondisi yang dipilih yaitu suhu annealing 52 °C dan konsentrasi primer 0.1 μM. Metode deteksi PCR simpleks dilakukan dengan kondisi denaturasi pada suhu 95 °C selama satu menit, annealing pada suhu 52 °C selama satu menit dan ekstensi pada suhu 72 °C selama satu menit. Limit deteksi PCR menggunakan primer HFQ dan CGB adalah DNA dengan konsentrasi 0.1 ng/μL.