| dc.description.abstract | Escherichia coli (E. coli) patogenik diketahui sebagai bakteri penyebab
sakit yang dapat menimbulkan infeksi, termasuk infeksi saluran kemih, diare, dan
penyakit-penyakit lainnya. Empat patotipe E. coli dikenal sebagai bakteri
penyebab diare (diarrheagenic E. coli/DEC) yang berasosiasi dengan pangan
(foodborne illness), yaitu enterotoksigenik E. coli (ETEC) yang mengandung
virulensi toksin labil dan stabil (lt dan st), enteropatogenik E. coli (EPEC) dengan
virulensi intimin (eae), enterohemoragik E. coli (EHEC) yang mengandung toksin
shiga (stx1 dan stx2), dan enteroinvasif E. coli (EIEC) yang mengandung plasmid
invasi (inv). Salah satu metode yang telah secara luas dan sering digunakan
sebagai metode diagnostik E. coli adalah polymerase chain reaction (PCR).
Proses identifikasi lebih dari satu jenis bakteri dengan teknik PCR perlu
dikembangkan. Pengembangan teknik PCR tersebut adalah dengan menerapkan
metode multipleks PCR. Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan metode
multipleks rt-PCR dengan menggunakan SYBR Green sebagai label fluoresen
untuk mendeteksi 4 patotipe E. coli, yaitu ETEC, EPEC, EHEC, dan EIEC pada
es batu.
Penelitian dilakukan melalui empat tahap, yaitu tahap persiapan, tahap
ekstraksi DNA, tahap pengujian primer, dan tahap aplikasi metode multipleks rt-
PCR. Ekstraksi DNA dilakukan dengan metode kombinasi chelex100-microwave.
Pengujian primer dilakukan pada empat konsentrasi berbeda, yaitu 0.125, 0.250,
0.375, dan 0.500 μM. Masing-masing konsentrasi diujikan secara simpleks rt-
PCR pada setiap target gen. Hasil konsentrasi terbaik selanjutnya dipilih untuk
analisis secara multipleks rt-PCR. Selanjutnya spesifisitas dan sensitivitas metode
multipleks rt-PCR ditentukan.
Kemurnian DNA hasil ekstraksi menunjukkan nilai yang baik, yaitu antara
1.80-1.94. Konsentrasi primer optimum untuk aplikasi metode multipleks adalah
0.25 uM untuk primer lt, dan 0.125 uM untuk primer st, eae, stx1, stx2, dan inv
dengan suhu annealing hasil optimasi sebesar 55 oC. Dua set pengujian multipleks
rt-PCR memungkinkan proses deteksi E. coli patogenik. Pembagian set multipleks
dilakukan berdasarkan selisih nilai suhu pelelehan diatas 2 oC. Set multipleks rt-
PCR pertama terdiri dari target gen lt-st-eae (78.5-75.0-81.6 oC) untuk deteksi E.
coli jenis ETEC dan EPEC. Set multipleks kedua terdiri dari target gen stx1-stx2-
inv (79.8-82.7-77.1 oC) untuk deteksi E. coli jenis EHEC dan EIEC dengan nilai
sensitivitas sebesar 0.1 ng DNA E. coli untuk setiap target gen. | id |
