Pengembangan Metode Multipleks real-time PCR untuk Deteksi Escherichia coli Patogenik pada Es Batu

Abstract

Escherichia coli (E. coli) patogenik diketahui sebagai bakteri penyebab sakit yang dapat menimbulkan infeksi, termasuk infeksi saluran kemih, diare, dan penyakit-penyakit lainnya. Empat patotipe E. coli dikenal sebagai bakteri penyebab diare (diarrheagenic E. coli/DEC) yang berasosiasi dengan pangan (foodborne illness), yaitu enterotoksigenik E. coli (ETEC) yang mengandung virulensi toksin labil dan stabil (lt dan st), enteropatogenik E. coli (EPEC) dengan virulensi intimin (eae), enterohemoragik E. coli (EHEC) yang mengandung toksin shiga (stx1 dan stx2), dan enteroinvasif E. coli (EIEC) yang mengandung plasmid invasi (inv). Salah satu metode yang telah secara luas dan sering digunakan sebagai metode diagnostik E. coli adalah polymerase chain reaction (PCR). Proses identifikasi lebih dari satu jenis bakteri dengan teknik PCR perlu dikembangkan. Pengembangan teknik PCR tersebut adalah dengan menerapkan metode multipleks PCR. Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan metode multipleks rt-PCR dengan menggunakan SYBR Green sebagai label fluoresen untuk mendeteksi 4 patotipe E. coli, yaitu ETEC, EPEC, EHEC, dan EIEC pada es batu. Penelitian dilakukan melalui empat tahap, yaitu tahap persiapan, tahap ekstraksi DNA, tahap pengujian primer, dan tahap aplikasi metode multipleks rt- PCR. Ekstraksi DNA dilakukan dengan metode kombinasi chelex100-microwave. Pengujian primer dilakukan pada empat konsentrasi berbeda, yaitu 0.125, 0.250, 0.375, dan 0.500 μM. Masing-masing konsentrasi diujikan secara simpleks rt- PCR pada setiap target gen. Hasil konsentrasi terbaik selanjutnya dipilih untuk analisis secara multipleks rt-PCR. Selanjutnya spesifisitas dan sensitivitas metode multipleks rt-PCR ditentukan. Kemurnian DNA hasil ekstraksi menunjukkan nilai yang baik, yaitu antara 1.80-1.94. Konsentrasi primer optimum untuk aplikasi metode multipleks adalah 0.25 uM untuk primer lt, dan 0.125 uM untuk primer st, eae, stx1, stx2, dan inv dengan suhu annealing hasil optimasi sebesar 55 oC. Dua set pengujian multipleks rt-PCR memungkinkan proses deteksi E. coli patogenik. Pembagian set multipleks dilakukan berdasarkan selisih nilai suhu pelelehan diatas 2 oC. Set multipleks rt- PCR pertama terdiri dari target gen lt-st-eae (78.5-75.0-81.6 oC) untuk deteksi E. coli jenis ETEC dan EPEC. Set multipleks kedua terdiri dari target gen stx1-stx2- inv (79.8-82.7-77.1 oC) untuk deteksi E. coli jenis EHEC dan EIEC dengan nilai sensitivitas sebesar 0.1 ng DNA E. coli untuk setiap target gen.