Pengembangan Analisis Listeria Monocytogenes Untuk Jajanan Pempek Dengan Real-Time Polymerase Chain Reaction (Rt-Pcr)

Abstract

Listeria (L.) monocytogenes merupakan bakteri patogen yang dapat menyebabkan bahaya serius bagi manusia. L. monocytogenes dapat menyebabkan komplikasi meningitis. Pangan jajanan anak sekolah sebagai salah satu pangan siap saji memiliki risiko bahaya L. monocytogenes yang tinggi terutama bila dikonsumsi oleh anak sekolah dasar. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengembangkan metode deteksi L. monocytogenes pada jajanan pempek menggunakan rt-PCR. Isolasi DNA L. monocytogenes dilakukan dengan membandingkan tiga metode ekstraksi yaitu: fenol:kloroform, pemanasan, dan kit komersial (QIAamp DNA Blood Mini Kit). Isolat DNA L. monocytogenes diamplifikasi menggunakan PCR dengan dua variabel primer yaitu LIM 2 dan LIMRE untuk deteksi gen iap, dan primer DG69 dan DG74 untuk deteksi gen hlyA. Pengujian dengan rt-PCR diawali dengan denaturasi awal pada 94 °C selama 5 menit diikuti dengan 30 siklus yang terdiri dari 45 detik denaturasi pada 94 °C, 45 detik annealing pada 55 °C, 45 detik ekstensi pada 72 °C dan ekstensi akhir pada 72 °C selama 7 menit. Kemudian dilanjutkan dengan program melting dengan transisi suhu 72-94 °C dan laju 0.5 °C/detik. Metode fenol:kloroform menunjukkan ekstraksi DNA terbaik yang lebih murni. Primer DG69/DG74 lebih spesifik dibandingkan dengan primer LIM 2/LIMRE. Kondisi running yang digunakan menghasilkan kurva amplifikasi spesifik sampai siklus ke-27. Deteksi DNA dari kultur murni L. monocytogenes menghasilkan persamaan kurva standar CT = 37.9-3.11 C dengan nilai r sebesar -0.990 dan limit deteksi (LOD) 3.2 x 103 CFU/mL. Deteksi DNA pada sampel pempek menghasilkan persamaan kurva standar CT = 41.03-3.69 C dengan nilai r sebesar -0.997 dan limit deteksi (LOD) 6.3 x 103 CFU/g. Primer DG69 dan DG74 dapat dipertimbangkan sebagai metode spesifik dan sensitif yang dapat diandalkan untuk mendeteksi L. monocytogenes pada jajanan pempek.