Konstruksi vektor sgRNA target gen PEPC1, AGP, dan CIS1 Chlorella vulgaris serta Prediksi pemotongan In Silico

Abstract

Pemanfaatan mikroalga Chlorella vulgaris sebagai bahan baku biodiesel terkendala oleh rendahnya produktivitas lipid. Peningkatan akumulasi lipid dapat dicapai dengan merekayasa jalur metabolisme kompetitor biosintesis lipid pada mikroalga. Rekayasa dapat dilakukan dengan penyuntingan gen PEPC1 yang berperan dalam sintesis oksaloasetat, gen AGP pada sintesis pati, serta gen CIS1 pada siklus asam trikarboksilat dengan memanfaatkan teknik CRISPR/Cas9 Multipleks. Penelitian ini merupakan langkah awal pengembangan sistem CRISPR/Cas9 Multipleks pada C. vulgaris. Hingga saat ini belum terdapat laporan terkait konstruksi modul dasar sgRNA untuk pengembangan sistem tersebut pada C. vulgaris yang menargetkan gen PEPC1, AGP, dan CIS1. Penelitian ini bertujuan mengonstruksi modul dasar single guide RNA gen PEPC1, AGP, dan CIS1 pada C. vulgaris, mengevaluasi efisiensi konstruksi, serta memprediksi lokasi pengeditan genom secara in silico. Konstruksi dilakukan menggunakan teknik Golden Gate Assembly berbasis enzim restriksi BbsI ke dalam vektor akseptor pAK004, pAK005, dan pAK006. Validasi pada penelitian ini difokuskan pada tingkat molekuler dan prediksi pemotongan secara in silico. Hasil penelitian menunjukkan bahwa konstruksi modul dasar keenam varian sgRNA berhasil dikonstruksi dengan efisiensi >90%. Analisis bioinformatika menunjukkan seluruh sgRNA memiliki spesifisitas tinggi dengan skor MIT >99,4 dan risiko off-target yang terprediksi minim karena adanya perbedaan basa antara sgRNA dan sekuens off-target. Seluruh sgRNA menargetkan wilayah ekson hulu dan hilir dari gen sehingga diprediksi secara in silico mampu menghasilkan delesi fragmen panjang apabila kedua sgRNA bekerja secara simultan pada genom target. Validasi fungsional lanjutan secara in vivo pada sel C. vulgaris perlu dilakukan untuk mengonfirmasi efektivitas penyuntingan genom CRISPR/Cas9 Multipleks yang diberikan.