Kloning dan Ekspresi Gen Lipase Ganoderma boninense di Escherichia coli

Abstract

Lipase merupakan enzim hidrolitik yang memiliki aplikasi luas di berbagai industri, namun lipase yang berasal dari jamur patogen masih belum banyak dikarakterisasi pada tingkat molekuler dan biokimia. Ganoderma boninense, sebagai penyebab penyakit busuk pangkal batang pada kelapa sawit, diketahui mensekresikan berbagai enzim hidrolitik, tetapi informasi mengenai lipasenya masih terbatas. Penelitian ini bertujuan untuk mengkloning, mengekspresikan, dan mengarakterisasi gen lipase (gblip1) dari G. boninense menggunakan sistem ekspresi heterolog. Gen full-length (gblip1-FL) dan konstruksi tanpa signal peptide N-terminal (gblip1?SP) diamplifikasi dari cDNA dan diklon ke dalam vektor ekspresi, kemudian ditransformasikan ke Escherichia coli. Ekspresi protein rekombinan dianalisis menggunakan SDS-PAGE, sedangkan aktivitas enzim ditentukan menggunakan substrat p-nitrofenil ester. Selain itu, analisis molecular docking dilakukan untuk mengkaji interaksi antara enzim dan substrat. Konstruksi Gblip1-FL tidak menunjukkan ekspresi protein rekombinan yang terdeteksi, yang diduga disebabkan oleh keberadaan signal peptide N-terminal yang tidak kompatibel dengan sistem ekspresi prokariotik, sehingga menyebabkan kesalahan pelipatan atau degradasi protein di dalam sel E. coli. Sebaliknya, penghilangan signal peptide pada konstruksi Gblip1?SP memungkinkan ekspresi protein rekombinan yang larut dan aktif. Di antara strain yang diuji, E. coli BL21 (DE3) menunjukkan aktivitas enzimatik tertinggi. Protein Gblip1?SP yang telah dipurifikasi menunjukkan preferensi terhadap substrat p-nitrofenil ester rantai sedang, dengan aktivitas spesifik maksimum pada p-nitrofenil oktanoat, sementara aktivitas terhadap substrat rantai panjang sangat rendah. Hasil analisis molecular docking mendukung temuan ini, yang menunjukkan interaksi yang lebih stabil antara enzim dan substrat rantai sedang pada konformasi lid terbuka. Sebagai kesimpulan, penelitian ini berhasil mengekspresikan lipase fungsional dari G. boninense secara heterolog dan menunjukkan bahwa penghilangan signal peptide merupakan langkah penting untuk produksi protein rekombinan pada E. coli. Hasil ini memberikan wawasan baru mengenai hubungan struktur dan fungsi lipase dari Basidiomycota serta potensi pemanfaatannya dalam bidang bioteknologi.

Lipases are hydrolytic enzymes with broad applications in various industries; however, lipases derived from pathogenic fungi remain poorly characterized at the molecular and biochemical levels. Ganoderma boninense, the causal agent of basal stem rot in oil palm, is known to secrete various hydrolytic enzymes, yet information regarding its lipases is still limited. This study aimed to clone, express, and characterize a lipase gene (gblip1) from G. boninense using a heterologous expression system. The full-length gene (gblip1-FL) and a truncated construct lacking the N-terminal signal peptide (gblip1?SP) were amplified from cDNA and cloned into an expression vector, followed by transformation into Escherichia coli. Recombinant protein expression was analyzed using SDS-PAGE, while enzymatic activity was determined using p-nitrophenyl ester substrates. In addition, molecular docking analysis was performed to investigate enzyme–substrate interactions. The Gblip1-FL construct did not produce detectable recombinant protein, which is likely due to the presence of an N-terminal signal peptide that is incompatible with the prokaryotic expression system, resulting in improper folding or protein degradation within E. coli cells. In contrast, removal of the signal peptide in the Gblip1?SP construct enabled the expression of a soluble and active recombinant protein. Among the tested strains, E. coli BL21 (DE3) exhibited the highest enzymatic activity. The purified Gblip1?SP protein showed substrate preference toward medium-chain p-nitrophenyl esters, with maximum specific activity toward p-nitrophenyl octanoate, while activity toward long-chain substrates was negligible. Molecular docking analysis supported these findings, indicating more stable interactions between the enzyme and medium-chain substrates in the open-lid conformation. In conclusion, this study successfully expressed a functional lipase from G. boninense in a heterologous system and demonstrated that removal of the signal peptide is a crucial step for recombinant protein production in E. coli. These findings provide new insights into the structure–function relationship of basidiomycete lipases and highlight their potential applications in biotechnology.