Profil Whole-Genome Sequencing pada Salmonella Resisten Ampisilin Asal Air Irigasi Pertanian

Abstract

Air irigasi merupakan sumber utama kontaminasi mikroorganisme patogen pada produk pertanian. Salah satu mikroorganisme patogen yang sering terdeteksi pada pangan dan lingkungannya adalah Salmonella spp.. Keberadaan Salmonella spp. yang resisten terhadap antibiotik menjadi ancaman serius bagi kesehatan global, terutama pada produk sayuran segar. Penelitian sebelumnya (Ardianti 2025) telah mengidentifikasi gen resistensi (blaTEM dan blaSHV) pada sembilan isolat Salmonella spp. dan satu isolat Klebsiella spp. yang berasal dari air irigasi pertanian tanaman selada menggunakan PCR standar. Penelitian ini merupakan studi lanjutan yang berfokus pada karakterisasi resistensi ampisilin pada isolat Salmonella spp. dari air irigasi pertanian dari tanaman selada. Studi ini bertujuan mengeksplorasi dan menganalisis isolat Salmonella spp. resisten ampisilin melalui pendekatan fenotipik dan genotipik berbasis next-generation sequencing (NGS) melalui whole-genome sequencing (WGS) yang dilakukan dalam empat tahapan penelitian. Tahap pertama dilakukan uji fenotipik terhadap ampisilin menggunakan metode Kirby–Bauer pada sembilan isolat terduga Salmonella spp., satu isolat Klebsiella spp., serta kontrol (Salmonella Typhimurium ATCC 14028 sebagai kontrol sensitif dan Salmonella BCID 1.3 sebagai kontrol resisten). Hasil pengujian menunjukkan bahwa dari sembilan isolat terduga Salmonella, terdapat 1 isolat sensitif (11,1%), 4 isolat resisten (44,4%), dan 4 isolat heteroresisten (44,4%). Kontrol Salmonella Typhimurium ATCC 14028 menunjukkan pola sensitif, sedangkan Salmonella BCID 1.3 menunjukkan pola resisten, dan isolat Klebsiella menunjukkan pola heteroresisten. Selanjutnya, seluruh isolat yang menunjukkan pola heteroresisten diinkubasi kembali dengan perpanjangan waktu hingga 48 jam. Setelah inkubasi 48 jam, isolat-isolat tersebut menunjukkan perubahan menjadi pola resistensi penuh. Dengan demikian, empat isolat terduga Salmonella dan Klebsiella yang sebelumnya heteroresisten berpotensi menjadi resisten terhadap ampisilin. Pada tahap kedua dilakukan uji konfirmasi terhadap sembilan isolat terduga Salmonella spp. menggunakan real-time PCR dengan target gen invA. Isolat Salmonella Typhimurium ATCC 14028 dan Salmonella BCID 1.3 digunakan sebagai kontrol positif, sedangkan isolat Klebsiella digunakan sebagai kontrol negatif. Hasil pengujian menunjukkan bahwa dari sembilan isolat terduga Salmonella, dua isolat (H.2.1 dan H.2.2) terkonfirmasi sebagai Salmonella dengan nilai Cq masing-masing 17,80 dan 18,32, sedangkan isolat lainnya menunjukkan hasil negatif serupa dengan kontrol negatif (Klebsiella). Kedua isolat terkonfirmasi tersebut (H.2.1 dan H.2.2) juga menunjukkan pola resisten terhadap ampisilin pada uji Kirby–Bauer yang mengindikasikan adanya Salmonella resisten antibiotik betalaktam dalam air irigasi. Tahap ketiga meliputi sekuensing NGS pada isolat Salmonella spp. H.2.1 dan H.2.2 yang dirakit secara de novo menjadi contig menggunakan Galaxy. Kedua isolat menunjukkan persentase GC sebesar 52% dengan ukuran genom sekitar 4,7– 4,8 Mbp serta kelengkapan tinggi (BUSCO 98,4–100%). Namun, isolat H.2.2 memiliki tingkat fragmentasi lebih tinggi (163 kontig; N50 58.287 bp) dibandingkan H.2.1 (57 kontig; N50 175.037 bp), sehingga kualitas perakitannya relatif lebih rendah. Pada kontrol positif, Salmonella Typhimurium ATCC 14028 dan Salmonella BCID 1.3 memiliki persentase GC 51,79–52,17% dengan ukuran genom sekitar 4,8 Mbp dan kelengkapan tinggi (BUSCO 98,4–100%); meskipun demikian, ATCC 14028 menunjukkan fragmentasi lebih tinggi (160 kontig; N50 67.266 bp) dibandingkan BCID 1.3 (56 kontig; N50 291.078 bp). Sebagai pembanding, kontrol negatif Klebsiella H.9.2 memiliki persentase GC lebih tinggi (57,79%) dan ukuran genom lebih besar (5,37 Mbp), serta kualitas perakitan lebih baik (45 kontig; N50 600.631 bp; BUSCO 100%). Secara keseluruhan, karakteristik genom isolat Salmonella (sampel dan kontrol positif) konsisten dan berbeda jelas dari Klebsiella, sehingga mendukung data untuk analisis WGS. Pada tahap keempat dilakukan analisis hubungan kekerabatan antar isolat dianalisis melalui pohon filogenetik, gen resistensi, gen virulensi, dan keberadaan plasmid. Hubungan kekerabatan antar isolat dianalisis menggunakan perangkat lunak MEGA versi 12 melalui konstruksi pohon filogenetik. Hasil analisis filogenetik menunjukkan isolat H.2.1 dan H.2.2 sebagai Salmonella Paratyphi B, BCID 1.3 sebagai S. Schwarzengrund, ATCC 14028 sebagai S. Typhimurium, dan Klebsiella H.9.2 sebagai Klebsiella quasipneumoniae. Penentuan serotipe Salmonella dilakukan menggunakan SeqSero2. Hasil ini konsisten antara pohon filogenetik dengan SeqSero2 untuk isolat Salmonella. Identifikasi gen resistensi antibiotik dilakukan menggunakan AMRFinderPlus v3.12.8 dengan coverage dan identity >99%. Hasilnya menunjukkan bahwa isolat S. Paratyphi B var. Java H.2.1 dan H.2.2 membawa gen blaTEM-135 (ampisilin) dan fosA4 (fosfomisin), dan memiliki plasmid tipe IncI1 yang berpotensi resistensi ampisilin yang dapat ditransfer secara horizontal. Isolat Salmonella BCID 1.3 memiliki keragaman gen resistensi yang lebih luas (beta-laktam, kuinolon, aminoglikosida, makrolida, dan sulfonamida) sehingga tergolong multi-drug resistant (MDR). S. Typhimurium ATCC 14028 tidak membawa gen resistensi, namun memiliki plasmid (IncFII dan IncFIB). Adapun isolat Klebsiella quasipneumoniae H.9.2 hanya memiliki gen blaOKP-B-8 yang berkontribusi terhadap resistensi beta-laktam (ampisilin). Identifikasi gen virulensi dilakukan menggunakan ABRicate v1.0.1 dengan basis data VFDB. Hasilnya menunjukkan bahwa seluruh isolat Salmonella memiliki gen adhesi (fimD dan fimH) untuk melekat ke sel inang, gen SPI-1 (invasi awal) dan SPI-2 (survival dan replikasi intraseluler), serta gen terkait dengan penekanan inflamasi, ketahanan terhadap kondisi nutrisi terbatas, dan potensi infeksi sistemik. Gen pembentuk biofilm hanya ditemukan pada isolat H.2.2 dan BCID 1.3, sementara itu isolat Klebsiella quasipneumoniae memiliki jumlah gen virulensi yang lebih sedikit, namun tetap menunjukkan potensi sebagai patogen. Temuan ini menunjukkan adanya risiko kontaminasi Salmonella dari air irigasi yang membawa gen virulensi dan resistensi ampisilin, terutama pada sayuran seperti selada.