Telaah pengklonan gen protease dari Bacillus stearo thermophilus ke dalam Escherichia coli

Abstract

Fragmen-fragmen genom dari Bacillus stearothermophilus, yang dipotong secara parsial dengan Eco RI atau HindIII, telah diklon dalam Escherichia coli dengan teknik shot gun cloning menggunakan plasmid pRK415 sebagai vektornya untuk gen protease. Media agar MacConkey (Jennings dan Beacham, 1989) dengan sedikit modifikasi dipakai untuk deteksi koloni pembawa plasmid rekombinan atau plasmid nonrekombinan. Media tersebut terdiri dari 10 g tripton, 5 g ekstrak kha­ mir, 10 g laktose, 0.075 g neutral red, 15 g agar dalam 1 L dH20, pH diatur pada 7 .4. Untuk deteksi ekspresi gen protease, media tersebut ditambahkan 2 % susu skim. Media ini dinamakan SMMCA (skim milk modified MacConkey agar). Penghilangan kristal violet, garam empedu dan garam memberikan hasil yang baik untuk deteksi koloni-koloni tersebut. Sel koinpeten untuk keperluan pengklonan disiapkan dengan metode miniprep, sesuai prosedur Lederberg dan Cohen (1974) dengan sedikit modifikasi, dilakukan dengan cara mensentrifusi 1.5 mL kultur fase log dalam tabung mikro setelah sebe­lumnya diinkubasikan selama 30 menit pada 0°C. Pelet sel dicuci dengan 1 mL 0.1 M CaC12 dingin, kemudian sel disuspensikan dalam 0.5 mL 0.1 M CaC12 dingin dan diinkubasikan pada 0°C selama 20 menit, sentrifusi terakhir dilakukan dan pelet sel disuspensikan dalam 0.2 mL 0.1 M CaC12 dingin, pada kondisi ini sel siap digu­ nakan untuk transformasi. Isolasi DNA kromosom dengan metode Marmur (1961) mendapatkan DNA dengan kualitas yang cukup baik, dan dapat dipakai untuk keperluan kloning, walauiv pun dilakukan tidak sampai pada tahap pemurnian lanjutan seperti penghilangan RNA dan pemekatan. Dari 500 mL kultur fase log diperoleh lebih kurang 2 mg DNA kromosom. ...