| dc.description.abstract | Pengujian DNA babi menggunakan real-time PCR banyak diaplikasikan
dalam proses sertifikasi halal maupun pengawasan produk pangan. Namun belum
adanya standar metode pengujian ini perlu dilakukan validasi. Penelitian ini
ditujukan untuk melakukan validasi metode amplifikasi DNA babi pada real-time
PCR dengan menggunakan primer terseleksi dan exogenous internal positive
control (IPC) sebagai alternatif metode yang digunakan pada Laboratorium
LPPOM MUI. Adapun validasi metode ekstraksi tidak menjadi cakupan pada tesis
ini karena menggunakan metode ekstraksi eksisting yang sudah tervalidasi pada
Laboratorium LPPOM MUI, yaitu dengan metode solid-phase extraction
menggunakan spin column.
Tahapan penelitian dimulai dari seleksi pustaka untuk mendapatkan primer
terseleksi dan dilanjutkan dengan ekstraksi sampel, uji efisiensi dan uji validasi
metode. Sebelum validasi metode amplifikasi DNA, dilakukan uji efisiensi
konsentrasi IPC terendah dan konsentrasi DNA sampel maksimum yang dapat
diamplifikasi. Hasil uji efisiensi menunjukkan penggunaan IPC pada konsentrasi
setengah dari konsentrasi awal, yaitu Exo IPC Mix 5X dan Exo IPC DNA 25X
masih memberikan performa yang baik dengan mengamplifikasi DNA IPC pada
Ct 27.57 ± 0.28 dan RFU pada 205.5 ± 14.85. Selain itu, diperoleh konsentrasi
maksimum isolat DNA yang dapat diamplifikasi dengan baik tanpa ada inhibisi
sebesar 100 ng/μl.
Validasi metode amplifikasi DNA babi dilakukan pada lingkup uji
spesifisitas, sensitifitas, linearitas, efisiensi amplifikasi dan uji robustness.
Sebanyak 23 sampel positif dan 23 sampel negatif dievaluasi pada uji spesifitas.
Dua sampel positif (kolagen babi dan kolagen peptida babi) menghasilkan hasil
false negative dan maksimum nilai Ct untuk hasil true positive adalah 35.69 ±
0.95 pada sampel kapsul gelatin babi. Metode yang digunakan sudah sesuai untuk
semua sampel yang diujikan, kecuali kolagen dan kolagen peptida. Di sisi lain,
tiga sampel negatif menghasilkan hasil false positive dan terdeteksi di atas Ct
42.26. Oleh karena itu, dari sejumlah sampel yang diujikan, batasan Ct maksimum
pada metode ini yang memberikan hasil true positive atau tidak memberikan hasil
false positive adalah 35.69 ± 0.95.
Nilai LOD yang memenuhi nilai keberterimaan berada pada konsentrasi
0.01 ng/μl pada Ct 33.29 ± 0.92 yang diperoleh dari hasil uji sensitivitas,
linearitas (r2 = 0.996) dan efesiensi PCR (ɛ = 96.32). Metode ini teruji robust
terhadap beberapa perubahan kecil seperti jenis master mix, volume master mix,
konsentrasi primer, konsentrasi probe dan suhu annealing, yaitu DNA babi pada
titik LOD yang masih teramplifikasi pada rentang 33.29 ± 0.92. Tidak hanya
robust terhadap beberapa perubahan kecil yang mungkin terjadi secara tidak
sengaja pada saat pengujian, metode ini juga tahan terhadap keberadaan beberapa
inhibitor seperti alginat, selulosa, EDTA, ion kalsium, kolagen peptida dan
polisakarida pada konsentrasi 1 μg/μl. Berdasarkan hasil validasi ini, metode
amplifikasi DNA babi dengan menggunakan primer terseleksi dan exogenous IPC
dapat digunakan sebagai metode alternatif pengujian DNA babi. | id |
