Konstruksi Gen Glukosa Oksidase Tanpa Sekuen Penyandi Spacer Peptida serta Subkloning ke dalam Plasmid pPICZα

Abstract

Glukosa oksidase (GOx) (EC 1.1.3.4) berfungsi mengkatalisis reaksi oksidasi dari β-D-glukosa menjadi D-glukono-δ-lakton dan hidrogen peroksida (H2O2). Enzim ini diketahui dihasilkan oleh beberapa jenis kapang. Aspergillus niger diketahui memproduksi enzim GOx yang lebih stabil dan digunakan sebagai sumber enzim GOx yang tersedia secara komersial. Isolat lokal A. niger IPBCC 08.610 yang digunakan pada penelitian ini diketahui menghasilkan kadar enzim GOx intraseluler yang lebih tinggi dibandingkan ekstraselulernya. Hal ini menjadi suatu kendala karena ekstraksi enzim intraseluler membutuhkan proses hilir yang lebih rumit. Produksi enzim GOx secara ekstraseluler pada Pichia pastoris dapat mengatasi masalah ini dan secara bersamaan dapat meningkatkan hasil produksi GOx rekombinan. Penelitian ini bertujuan mendapatkan gen penyandi GOx tanpa sinyal peptida aslinya yang akan disubklon ke dalam plasmid pPICZα pada sisi restriksi enzim XhoI dan XbaI agar terfusi secara in frame dengan sinyal sekresi α-mating factor (α-MF) tanpa menyertakan sekuen penyandi spacer peptida EAEA pada ujung-5’. Gen GOx diamplifikasi melalui dua tahapan reaksi PCR dari plasmid pGEM®-T Easy‒GOx. Amplikon gen GOx yang diperoleh berukuran 1775 pb yang terdiri atas situs restriksi XhoI (ujung-5’), sekuen penyandi gen GOx, dan situs restriksi XbaI (ujung-3’). Subkloning amplikon ini ke dalam plasmid pPICZα diharapkan akan menghasilkan plasmid rekombinan dengan ukuran 5269 pb.

Glucose oxidase (GOx) (EC 1.1.3.4) catalyzes the oxidation of β-D-glucose to form D-glucono-δ-lactone and hydrogen peroxide (H2O2). The enzyme is well known to be produced from several species of fungis. Aspergillus niger is known to produced a more stable GOx and used as source of commercially available GOx. A local isolate of A. niger IPBCC 08.610 used in this study produced higher level of intracellular GOx enzyme than its extracellular. This fact presents a problem because intracellular enzyme extraction will need a more complicated downstream processing. Production of extracellular GOx in Pichia pastoris would overcome this problem and concomitanly could increase the yield of recombinant GOx production. This study aims to obtain the GOx gene without the original signal peptide to be subcloned into the pPICZα plasmid, fused in frame with the secretion signal α-mating factor (α-MF) without the sequences that encodes spacer peptide EAEA at its 5’-end. The GOx gene construction was carried out using a two steps PCR amplification method from pGEM®-T Easy‒GOx plasmid. The GOx amplicon is 1775 bps in length consisting of the XhoI restriction site (5’-end), the GOx gene encoding sequence, and the XbaI restriction site (3’-end). Subcloning this amplicon into the pPICZα plasmid is expected to produce a recombinant plasmid that have a length of 5269 bps.