Konstruksi Gen Glukosa Oksidase Tanpa Sekuen Penyandi Spacer Peptida serta Subkloning ke dalam Plasmid pPICZα
View/ Open
Date
2020Author
Adhiswara, Wina Faiz
Seno, Djarot Sasongko Hami
Kurniatin, Popi Asri
Fuad, Asrul Muhamad
Metadata
Show full item recordAbstract
Glukosa oksidase (GOx) (EC 1.1.3.4) berfungsi mengkatalisis reaksi oksidasi
dari β-D-glukosa menjadi D-glukono-δ-lakton dan hidrogen peroksida (H2O2).
Enzim ini diketahui dihasilkan oleh beberapa jenis kapang. Aspergillus niger
diketahui memproduksi enzim GOx yang lebih stabil dan digunakan sebagai
sumber enzim GOx yang tersedia secara komersial. Isolat lokal A. niger IPBCC
08.610 yang digunakan pada penelitian ini diketahui menghasilkan kadar enzim
GOx intraseluler yang lebih tinggi dibandingkan ekstraselulernya. Hal ini menjadi
suatu kendala karena ekstraksi enzim intraseluler membutuhkan proses hilir yang
lebih rumit. Produksi enzim GOx secara ekstraseluler pada Pichia pastoris dapat
mengatasi masalah ini dan secara bersamaan dapat meningkatkan hasil produksi
GOx rekombinan. Penelitian ini bertujuan mendapatkan gen penyandi GOx tanpa
sinyal peptida aslinya yang akan disubklon ke dalam plasmid pPICZα pada sisi
restriksi enzim XhoI dan XbaI agar terfusi secara in frame dengan sinyal sekresi
α-mating factor (α-MF) tanpa menyertakan sekuen penyandi spacer peptida EAEA
pada ujung-5’. Gen GOx diamplifikasi melalui dua tahapan reaksi PCR dari plasmid
pGEM®-T Easy‒GOx. Amplikon gen GOx yang diperoleh berukuran 1775 pb yang
terdiri atas situs restriksi XhoI (ujung-5’), sekuen penyandi gen GOx, dan situs
restriksi XbaI (ujung-3’). Subkloning amplikon ini ke dalam plasmid pPICZα
diharapkan akan menghasilkan plasmid rekombinan dengan ukuran 5269 pb. Glucose oxidase (GOx) (EC 1.1.3.4) catalyzes the oxidation of β-D-glucose to
form D-glucono-δ-lactone and hydrogen peroxide (H2O2). The enzyme is well
known to be produced from several species of fungis. Aspergillus niger is known
to produced a more stable GOx and used as source of commercially available GOx.
A local isolate of A. niger IPBCC 08.610 used in this study produced higher level
of intracellular GOx enzyme than its extracellular. This fact presents a problem
because intracellular enzyme extraction will need a more complicated downstream
processing. Production of extracellular GOx in Pichia pastoris would overcome
this problem and concomitanly could increase the yield of recombinant GOx
production. This study aims to obtain the GOx gene without the original signal
peptide to be subcloned into the pPICZα plasmid, fused in frame with the secretion
signal α-mating factor (α-MF) without the sequences that encodes spacer peptide
EAEA at its 5’-end. The GOx gene construction was carried out using a two steps
PCR amplification method from pGEM®-T Easy‒GOx plasmid. The GOx amplicon
is 1775 bps in length consisting of the XhoI restriction site (5’-end), the GOx gene
encoding sequence, and the XbaI restriction site (3’-end). Subcloning this amplicon
into the pPICZα plasmid is expected to produce a recombinant plasmid that have a
length of 5269 bps.
Collections
- UT - Biochemistry [1326]