Skrining Gen Target untuk Pengembangan Metode Deteksi Cronobacter spp. dalam Susu Formula Menggunakan PCR Real Time

Abstract

Bakteri patogen oportunistik Cronobacter spp. diketahui menyebabkan penyakit seperti necrotizing enterocolitis (NEC) dan meningitis pada kelompok bayi tertentu. Cronobacter spp. telah diisolasi dari berbagai macam makanan kering asal Indonesia. Cronobacter spp. yang terdapat pada makanan kering diduga berada dalam kondisi stres bahkan VBNC. Bakteri pada kondisi tersebut tidak dapat terdeteksi dengan metode plate count. Teknik PCR real time atau quantitative PCR (qPCR) dapat menjadi alternatif untuk bakteri tersebut. Cronobacter spp. dapat bertahan dalam makanan kering karena memiliki gen yang berperan dalam merespon kondisi stres yaitu gen rpoS dan grxB. Gen lain dari gen virulen yang mengalami upregulation saat kondisi stres yaitu gen hfq dan ompA. Sepuluh isolat lokal C. sakazakii diketahui memiliki gen rpoS, grxB, hfq, dan ompA. Penelitian ini bertujuan untuk menentukan gen target untuk deteksi Cronobacter spp., merancang primer gen target terpilih untuk deteksi Cronobacter spp., dan aplikasi primer terpilih untuk deteksi cepat bakteri Cronobacter spp. pada susu formula menggunakan PCR real time. Gen target dipilih berdasarkan analisis sekuen, primer spesifik dirancang melalui pendekatan in silico, inklusivitas uji PCR real time dilakukan untuk deteksi Cronobacter spp., dan sensitifitas uji PCR real time dinyatakan dengan kurva standar. Berdasarkan hasil analisis sekuen didapatkan hasil bahwa gen grxB ditentukan sebagai gen target untuk deteksi Cronobacter spp. menggunakan PCR real time. Primer gen target dirancang berdasarkan wilayah konservasi C. sakazakii yang tidak dapat mengamplifikasi non Cronobacter spp. Primer yang dipilih adalah GBCF yaitu urutan sekuen gen grxB isolat lokal C. sakazakii pada posisi 62-81 dan GBCR pada posisi 141-160. Primer tersebut mampu mendeteksi 24 Cronobacter spp., serta dapat diaplikasikan untuk deteksi cepat Cronobacter spp. pada susu formula dengan konsentrasi DNA terendah 1 x 10-4 (ng/μL) atau setara dengan jumlah bakteri sebanyak 1.01 x 101 sel. Temuan ini dapat berkontribusi untuk pengembangan deteksi cepat Cronobacter spp. menggunakan PCR real time.