B-Glukosidase dari Isolat Lokal Aspergillus niger: Produksi, Karakterisasi dan Aplikasinya pada Peningkatan Kandungan Aglikon Isoflavon Tepung Kedelai (Glycine max (L.) Merr.).

Abstract

-Glukosidase ( -D-glucoside glucohydrolase, EC 3.2.1.21) merupakan bagian dari kompleks multi enzim selulase yang terdiri dari endoglukanase, selobiohidrolase, eksoglukohidrolase dan -glukosidase yang bekerja secara sinergis untuk hidrolisis lengkap selulosa menjadi glukosa melalui beberapa tahapan reaksi hidrolisis. Aspergillus niger merupakan mikroorganisme penghasil selulase dan -glukosidase yang cukup potensial. Produk enzim ekstraseluler yang berasal dari A. niger dinyatakan oleh Food and Drug Administration (FDA) Amerika Serikat sebagai GRAS (generally regarded as safe). -Glukosidase memiliki banyak manfaat dalam industri pangan diantaranya untuk meningkatkan kandungan aglikon isoflavon kedelai dengan menghidrolisis glikosida isoflavon (daidzin dan genistin) menjadi bentuk aglikonnya (daidzein dan genistein). Aglikon isoflavon yang merupakan bentuk bebas dari isoflavon memiliki bioaktivitas yang lebih tinggi dan lebih mudah diabsorbsi di intestin daripada bentuk glikosidanya. Penelitian ini bertujuan untuk: (1) menentukan substrat dari biomassa lignoselulosa (jerami, sekam, dan dedak padi) dan tepung beras pecah kulit yang terbaik untuk produksi -glukosidase dari isolat lokal A. niger, (2) menentukan kondisi fermentasi untuk produksi maksimum -glukosidase, (3) melakukan purifikasi dan karakterisasi enzim dan (4) menggunakan enzim untuk biokonversi glikosida isoflavon tepung kedelai menjadi aglikon isoflavon. Pada penelitian ini dilakukan produksi -glukosidase menggunakan tiga isolat lokal Aspergillus niger, yaitu InaCC F57, InaCC F98 dan Bio 2173. Produksi enzim dilakukan dengan fermentasi padat menggunakan substrat biomassa lignoselulosa yang terdiri dari jerami, sekam, dan dedak padi serta tepung beras pecah kulit. Pengujian aktivitas enzim dilakukan dengan menggunakan substrat p-nitrophenyl- -D-glucopyranoside. Pemurnian enzim dilakukan dengan pengendapan menggunakan ammonium sulfat, dialisis dan kromatografi penukar anion menggunakan matriks kolom DEAE-streamline. Karakterisasi enzim meliputi suhu dan pH optimum enzim, pengaruh ion logam terhadap aktivitas enzim, penentuan bobot molekul enzim dengan SDS-PAGE dan analisis komposisi asam amino enzim dengan HPLC. Pada tahap akhir penelitian, dilakukan aplikasi ekstrak kasar enzim untuk meningkatkan kandungan aglikon isoflavon (daidzein dan genistein) tepung kedelai. Hasil penelitian menunjukkan jerami, sekam dan dedak padi serta tepung beras pecah kulit merupakan substrat yang dapat digunakan sebagai medium fermentasi padat untuk produksi -glukosidase. Produksi -glukosidase oleh ketiga isolat A. niger (InaCC F57, InaCC F98, Bio 2173) menunjukkan aktivitas maksimum pada substrat dedak, dengan aktivitas tertinggi dihasilkan oleh isolat A. niger InaCC F98 yaitu sebesar 5,43 ± 0,27 U/mL, diikuti oleh isolat A. niger InaCC F57 (2,45 ± 0,16 U/mL) dan isolat A. niger Bio 2173 (1,71 ± 0,03 U/mL). Pada penentuan kondisi fermentasi untuk menghasilkan produk maksimum -glukosidase oleh ketiga isolat A. niger (InaCC F57, InaCC F98 dan Bio 2173) diperoleh kondisi fermentasi, sebagai berikut: pH awal media fermentasi 2,0 (A. niger InaCC F57 dan Bio 2173) dan 3,0 (A. niger InaCC F98), waktu inkubasi fermentasi 5 hari (A. niger InaCC F57) dan 7 hari (A. niger InaCC F98 dan Bio 2173), rasio kandungan air terhadap substrat 1,5:1 (A. niger InaCC F57 dan InaCC F98) dan 1:1 (A. niger Bio 2173) dan suhu inkubasi fermentasi 32oC. Penambahan larutan garam mineral Mandels ke dalam media fermentasi pada kondisi fermentasi maksimum menyebabkan peningkatan aktivitas ekstrak kasar -glukosidase masing-masing sebesar 26,22% (A. niger InaCC F57), 36,58% (A. niger InaCC F98) dan 26,88% (bio 2173) dibandingkan dengan fermentasi tanpa penambahan larutan garam mineral Mandels. Ekstrak kasar -glukosidase dari isolat A. niger InaCC F98 dan fraksi-fraksi dari setiap tahapan pemurnian, yaitu fraksi pengendapan ammonium sulfat dengan kejenuhan 80%, fraksi dialisis, dan fraksi enzim puncak P1, P2 dan P3 hasil kromatografi kolom penukar anion DEAE-streamline memiliki suhu optimum 60oC, pH optimum 4,5. Penambahan ion logam CuSO4 (1 mM) dapat menghambat aktivitas enzim sebesar 32% – 65%. Rasio residu asam amino hidrofobik terhadap residu asam amino hidrofilik adalah 50,67 : 49,33 (P2) dan 67,71 : 32,29 (P3). Berdasarkan hasil analisis SDS-PAGE dan zimografi, - glukosidase murni dari fraksi enzim puncak P2 dan P3 memiliki berat molekul sekitar 39,8 kDa. Ekstrak kasar -glukosidase dari isolat A. niger InaCC F98 dapat digunakan untuk meningkatkan kandungan aglikon isoflavon tepung kedelai. Pada inkubasi ekstrak tepung kedelai kuning dan kedelai hitam (bebas lemak) dengan ekstrak kasar -glukosidase (0,10 U/mL, 1 mL) selama 4 jam pada suhu 60oC dapat meningkatkan kandungan aglikon isoflavon daidzein dan genistein dari tepung kedelai kuning, masing-masing sebesar 80,71% dan 98,47% dan tepung kedelai hitam sebesar 48,41% dan 30,39% dibandingkan dengan ekstrak tepung kedelai yang tidak diinkubasi enzim.