| dc.description.abstract | Pemilihan gen target yang akan diinsersikan ke dalam genom tanaman
dalam kegiatan rekayasa genetika tanaman merupakan salah satu hal yang penting
dalam menentukan keberhasilan perbaikan sifat yang diinginkan. Gen target yang
dikendalikan oleh promoter spesifik jaringan atau organ dalam kegiatan rekayasa
genetika tanaman sangat diperlukan, untuk menghindari terjadinya fenotipe yang
tidak diinginkan pada tanaman transgenik yang dihasilkan. Promoter adalah suatu
bagian dari gen yang sangat penting dalam pengaturan ekspresi suatu gen.
Promoter spesifik akar penting dalam pengaturan ekspresi dari gen-gen yang
terkait dengan respon terhadap cekaman abiotik dan penyerapan nutrisi. Tujuan
dari penelitian ini adalah untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi gen dan
promoter gen OsAER1.
Bagian tiga dari disertasi ini menjelaskan tentang isolasi dan karakterisasi
gen OsAER1 pada tanaman padi. Sekuen genomik gen OsAER1 (Oryza sativa 2-
alkenal reduktase-1) diamplifikasi dari 4 kultivar padi, yaitu Awan Kuning, IR64,
Way Rarem, dan IR20, kemudian dan disekuensing. Analisis prediksi gen
menunjukkan bahwa gen OsAER1 terdiri dari 3 ekson dan 2 intron, dengan ukuran
CDS utuh sebesar 1.080 bp. Analisis filogenetik menunjukkan bahwa sekuen CDS
utuh OsAER1 dari 4 kultivar padi sangat mirip dengan lokus XM_015760039.1
yang ada di GenBank dari tanaman Oryza sativa grup Japonica. Lokus tersebut
diprediksi menyandikan NADP-dependent alkenal double bond reductase P1
(alkenal reductase).
Gen alkenal reduktase telah diketahui berfungsi sebagai gen antioksidan
yang dapat mendetoksifikasi senyawa reaktif karbonil yang disebabkan oleh
cekaman oksidatif. Bagian empat dari disertasi ini menjelaskan tentang isolasi dan
karakterisasi promoter OsAER1 yang berasal dari padi. Analisis ekspresi gen
OsAER1 pada organ akar, batang dan daun dari 4 kultivar padi (Awan Kuning,
IR64, Way Rarem, dan IR20) dilakukan dengan menggunakan metode qRT-PCR.
Analisis ekspresi menunjukkan bahwa gen OsAER1 diekspresikan sangat kuat di
akar, tetapi hanya diekspresikan lemah di batang dan daun padi kultivar Awan
Kuning dan IR64. Fragmen dengan ukuran 3.082 bp dari start kodon ATG ke arah
hulu dari gen OsAER1 diamplifikasi dan diinsersikan ke dalam vektor kloning,
dan disekuensing. Analisis sekuen promoter OsAER1 dengan ukuran 3.082 bp
menunjukkan bahwa terdapat 119 motif cis acting element yang ada pada
promoter yang terlibat dalam pengendalian pertumbuhan dan perkembangan
tanaman atau dalam proses fisiologi tanaman, khususnya dalam pertahanan
tanaman terhadap cekaman abiotik. Fragmen promoter OsAER1 yang berukuran
3.082 bp disambungkan dengan gen GUS pada vektor biner pCAMBIA1300int-
GUS-tNOS, dan ditransformasikan ke dalam tanaman padi dan tembakau.
Analisis ekspresi GUS di tanaman padi dilakukan dari fase kecambah sampai fase
generatif, sedangkan untuk tanaman tembakau dilakukan pada fase kecambah
umur 3, 10, dan 20 hari setelah semai. Analisis aktivitas promoter OsAER1
menunjukkan bahwa promoter tersebut mengendalikan ekspresi gen secara
dominan dan terus menerus di akar tanaman padi dari fase kecambah sampai fase
generatif. Analisis histokimia pada penampang melintang tanaman padi
transgenik menunjukkan bahwa promoter OsAER1 mengarahkan ekspresi gen
GUS di hampir diseluruh organ akar, yaitu pada jaringan epidermis, korteks,
endodermis dan berkas pengangkut. Pola ekspresi yang berbeda diamati di
tanaman tembakau transgenik, di mana ekspresi GUS diamati di bagian berkas
pengangkut daun. Perbedaan pola ekspresi GUS di tanaman padi dan tembakau
transgenik menunjukkan adanya faktor endogen terhadap aktivitas promoter di
tanaman transgenik. Analisis ekspresi GUS juga dilakukan setelah tanaman
diinduksi dengan NaCl, AlCl3, zat pengatur tumbuh (ABA dan IAA), serta
perlakuan rendaman. Ekspresi GUS meningkat di bagian ujung akar dan meristem
akar padi transgenik yang diberi perlakuan NaCl dan AlCl3 dibandingkan dengan
tanaman transgenik yang tidak diberi perlakuan. Ekspresi GUS juga meningkat
pada tanaman yang diinduksi oleh adanya ABA, IAA dan rendaman. Hasil
tersebut didukung dengan adanya motif cis acting element yang dilibatkan dalam
cekaman abiotik di dalam sekuen promoter gen OsAER1, seperti W-Box (TGAC),
MYB (YAACKG), MYC (CANNTG), ABRE (YACGTGKC), ARF( TGTCTC),
DRE (RCCGAC), RAV (CAACA), LTRE (CCGAC), dan GCC-Box (GCCGCC).
Pada bagian lima disertasi ini menjelaskan analisis fungsi promoter gen
OsAER1 pada tanaman tembakau. Kegiatan ini diawali dengan pembuatan seri
delesi promoter (mutan promoter) dengan ukuran -2.094 bp (PA4), -1.562 bp
(PA3), -1.026 bp (PA2), dan -549 bp (PA1) dari start kodon (ATG). Mutan
promoter kemudian dirakit dalam konstruk vektor biner pCAMBIA1300int-GUStNOS.
Konstruk mutan promoter digunakan untuk transformasi transien yang
dapat memprediksi aktivitas suatu promoter dalam kecambah utuh tembakau 5
hari setelah perkecambahan. Uji GUS menunjukkan bahwa promoter OsAER1
mengarahkan ekspresi gen di bagian akar, hipokotil, dan kotiledon, tetapi tidak di
helaian daun. Rangkaian konstruk mutan promoter kemudian ditransfomasi secara
stabil ke tanaman tembakau. Ekspresi gen GUS ditemukan di akar, hipokotil,
kotiledon, dan petiole dari kecambah umur 10 dan 20 hari setelah perkecambahan.
Pada bagian ke enam disertasi ini dijelaskan tentang analisis fungsi
promoter OsAER1 pada tanaman padi transgenik. Konstruk 4 mutan promoter
(PA1, PA2, PA3, dan PA4) digunakan untuk transformasi stabil tanaman padi
kultivar Nipponbare. Uji GUS menunjukkan bahwa ke empat mutan promoter
mengendalikan ekspresi gen GUS secara konstan di akar padi dari fase kecambah
sampai fase generatif. Selain itu, aktivitas GUS juga dideteksi pada anther dan
lapisan aleuron benih padi umur 7, 12, 20 hari setelah anthesis. Kebocoran
ekspresi GUS di culm selama fase pengisian benih terdeteksi pada tanaman
transgenik yang ditransformasi dengan promoter mutan PA3, tetapi kebocoran ini
tidak terdeteksi pada tanaman transgenik yang ditransformasi dengan promoter
mutan PA4. Hal ini menunjukkan bahwa mutan promoter OsAER1 PA4
merupakan minimal promoter spesifik akar yang menekan ekspresi gen di bagian
culm pada fase pengisian benih. Mutan promoter PA1 mengendalikan ekspresi
GUS hampir disemua bagian organ tanaman, sehingga berfungsi sebagai promoter
konstitutif. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa promoter OsAER1 dapat
dimanfaatkan untuk pengendali ekspresi gen target secara terus menerus di organ
akar | id |
