| dc.description.abstract | Enzim lipase yang dihasilkan bakteri Ralstonia menarik perhatian besar karena potensial bioteknologinya. Namun, enzim ini membutuhkan chaperon untuk membentuk lipase dalam konformasi aktif. Tujuan penelitian ini adalah mengkloning dan ko-ekspresi lipase dengan chaperon spesifiknya dari Ralstonia pickettii BK6 serta mengkarakterisasi sifat biokimia dari lipase tersebut.
Bakteri lipolitik diisolasi dari limbah kulit biji jambu mete yang diinokulasi di media agar-agar Luria Bertani dengan metode sebar. Identifikasi bakteri secara molekuler berdasarkan gen 16S rRNA, sedangkan gen lipase (lipRM) dan chaperon (lifRM) diisolasi dengan teknik PCR yang melibatkan primer RM_LC_lip yang telah didesain sebelumnya. Kedua gen dikonstruksi dalam bentuk sistem operon baik ke vektor plasmid pGEM®-T Easy maupun ke pET15by. Vektor pGEM®-T Easy rekombinan dikloning ke Escherichia coli DH5α dengan metode kejut panas. Plasmid rekombinan pET15by dikoekspresikan ke E. coli BL21 (DE3) pLyss, sedangkan pGEM®-T Easy dikoekspresikan ke DH5α, HB101, dan S17_1λ pir. Protein dipurifikasi secara parsial dan penentuan massa molekuler lipase berdasarkan analisis SDS-PAGE dan zimogram pada media TCN. Selain itu, lipase dikarakterisasi beberapa sifat biokimianya.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa isolat BK6 identik 99% dengan Ralstonia pickettii. Struktur gen lipase dan chaperon dari isolat BK6 berupa sistem operon. LipRM tersusun atas 330 asam amino dengan 43-residu sebagai signal peptida yang memiliki massa molekuler sekitar 30 kDa. LifRM memiliki 350 asam amino yang diidentifikasi mengandung signal peptida sebanyak 26 residu. Ko-ekspresi lipase dan chaperon spesifiknya dengan mekanisme pelipatan secara in vivo menghasilkan lipase dalam konformasi aktif.
LipRM memiliki aktivitas optimum pada suhu 50-55 ºC pH 8.0 dengan substrat spesifik ester laurat (C12). Triasilgliserol pada minyak kelapa sawit lebih efektif dihidrolisis dibandingkan dengan minyak zaitun, minyak kanola, minyak kulit padi, minyak jagung, minyak bunga matahari, dan minyak kedelai. Konsentrasi 1 mM ion logam (Fe2+, Cu2+, Mg2+, Ca2+, Na+, Mn+, K+, or Zn2+) menurunkan hingga 50% aktivitas enzim. Namun, penambahan pelarut organik 30%, seperti butanol, propanol, metanol, etanol, dan n-heksan mampu meningkatkan aktivitas enzim secara signifikan. LipRM stabil terhadap pemberian metanol 40-70%, etanol 80%, dan SDS 1%, tetapi pemberian larutan deterjen 5% seperti, triton X-100, tween-20, tween-80, dan SDS menghambat aktivitas enzim. Aktivitas spesifik lipase BK6 yang terpurifikasi secara parsial pada E. coli BL21 (DE3) pLyss, DH5α, HB101, dan S17_1λ pir masing-masing sebesar 1.19 ± 0.24 U/mg, 32.29 ± 0.54 U/mg, 42.87 ± 3.81 U/mg, dan 173.16 ± 8.77 U/mg. Hasil penelitian ini dapat menjadi salah satu strategi dalam mengekspresikan lipase dalam konformasi aktif khususnya yang termasuk kelompok lipase subfamili I.2. | id |
