Peningkatan Aktivitas Enzim L-Arabinosa Isomerase Dari Geobacillus Stearothermophilus Dengan Teknik Site Directed Mutagenesis

Abstract

Enzim L-arabinosa isomerase (L-AI) merupakan enzim yang berperan dalam mediasi isomerisasi antara D-galaktosa menjadi D-tagatosa. D-tagatosa, adalah pemanis yang paling mirip dalam rasa dan sifat fisik dengan sukrosa dari seluruh pemanis, selain itu juga dikenal sebagai pengganti gula alami. D-tagatosa merupakan gula langka yang bersifat malabsorbsi atau sulit diserap oleh usus halus. Keunggulan sifat tersebut yang menjadikan D-tagatosa merupakan gula langka dapat dijadikan sebagai salah satu alternatif pengganti sukrosa. Sehingga banyak metode digunakan untuk meningkatkan hasil produksi D-tagatosa dari proses enzimatik L-AI. Produksi enzim L-AI pada umumnya memiliki berbagai kendala, seperti rendahnya aktivitas enzim dari galur murni yang telah diisolasi sebelumnya. Pendekatan rekayasa genetik merupakan alternatif yang dapat dilakukan untuk mendapatkan enzim L-AI dengan aktivitas yang lebih baik, salah satunya adalah dengan melakukan mutasi pada suatu posisi tertentu untuk memperbaiki sifat enzim. Oleh karena itu penelitian ini dilakukan dengan tujuan mengkonstruksi gen araA pada vektor pRHA dan mengekspresikan protein rekombinan L-AI di sitoplasma Escherichia coli serta meningkatkan produksi D-tagatosa dengan berbagai variasi mutasi. Gen penyandi enzim L-AI telah berhasil dikloning ke dalam vektor pRHA, dan diekspresikan di sitoplasma E. coli NiCo21 dengan ukuran protein 57 kDa. Gen tersebut telah berhasil dimutasi dengan menggunakan teknik site directed mutagenesis pada titik mutasi S393T, F280N, F280L dan mutasi ganda S393T-F280L dan S393T-F280N. Lebih lanjut lagi hasil uji aktivitas enzim L-AI dari kelima mutan dan tipe liar, empat diantaranya menunjukkan adanya peningkatan aktivitas enzim L-AI. Mutan S393T memiliki aktivitas spesifik tertinggi yakni 0.518 atau 159% dan diikuti oleh mutan F280L, F280N dan S393T-F280L yakni 24.7%, 15%, dan 14% berturut-turut, dibandingkan dengan tipe liar. Sedangkan penurunan aktivitas enzim ditunjukkan pada mutan S393T-F280N dengan penurunan aktivitas 6% di bandingkan tipe liar. Mutan S393T memiliki nilai untuk dikembangkan di dunia industri.