Pengklonan Dan Ekspresi Gen Penyandi Partikulat Metan Monooksigenase Domain Cupredoxin (Spmob) Pada Escherichia Coli.

Abstract

Metan merupakan gas yang berkontribusi terhadap pemanasan global dan menyerap radiasi inframerah yang lebih tinggi dibandingkan CO2. Gas metan dapat digunakan sebagai sumber karbon oleh bakteri metanotrof. Jalur metabolisme awal pada bakteri metanotrof adalah reaksi konversi metan menjadi metanol yang dikatalisis oleh enzim metan monoksigenase (MMO). Terdapat dua tipe MMO yaitu soluble MMO (sMMO) dan partikulat MMO (pMMO). Enzim pMMO adalah enzim yang dominan dalam mengoksidasi metan di alam. Enzim pMMO adalah protein integral membran yang terdiri dari tiga subunit yaitu subunit pmoC, pmoA, dan pmoB yang disandikan oleh operon pmoCAB. Bakteri metanotrof memiliki laju pertumbuhan yang lambat, sehingga dilakukan pendekatan lain yaitu dengan mengekspresikan operon penyandi pMMO pada Escherichia coli. Namun demikian, ekspresi seluruh gen penyandi pMMO di E. coli sulit dilakukan sehingga menimbulkan dugaan bahwa protein integral ini bersifat toksis bagi bakteri ini. Oleh karena itu, pada penelitian ini dilakukan pendekatan lain yaitu dengan mengekspresikan hanya sisi aktif dari enzim pMMO; subunit pmoB domain cupredoxin yang disandikan oleh gen spmoB di E. coli, Gen spmoB yang digunakan adalah gen dari bakteri Methylococcus capsulatus (Bath). Urutan nukleotida gen ini diperoleh dari situs National Center for Biotechnology Information (NCBI) untuk proses pembuatan gen sintetik. Beberapa modifikasi dilakukan sehingga gen ini diekspresikan di sitoplasma. Gen spmoB diekspresikan di E. coli BL21 (DE3) menggunakan promotor T7 yang terdapat di dalam vektor ekspresi, yaitu pET15b. Analisis ekspresi dilakukan dengan SDS-PAGE dan pengujian aktivitas oksidasi metan oleh protein spmoB dilakukan dengan mengukur akumulasi metanol yang dihasilkan. Ukuran gen penyandi domain cupredoxin adalah 891 pb. Gen ini berhasil diekspresikan di E. coli BL21 (DE3) dibawah promotor T7. Analisis ekspresi gen dengan SDS-PAGE menunjukan bahwa ekspresi berlebih dapat dilakukan dengan induksi isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) konsentrasi 0.1, 0,5, dan 1.0 mM. Suhu 27 oC dan 37 oC dapat digunakan sebagai suhu inkubasi. protein spmoB menghasilkan protein rekombinan berukuran sekitar 38.9 kDa. Pengujian aktivitas protein spmoB menunjukan jumlah metanol yang terakumulasi selama oksidasi metan oleh bakteri rekombinan adalah sebesar 0.114 mmol mL kultur-1 jam-1. Protein rekombinan ini tidak menimbulkan toksisitas bagi E. coli sehingga memungkinkan untuk analisis lebih lanjut terhadap potensi aplikasi protein dan gen penyandi spmoB.