Konstruksi Vektor Ekspresi Dan Ekspresi Protein Rekombinan Superoksida Dismutase (Cuznsod) Dari Melastoma Malabathricum L. Pada Escherichia Coli.

Abstract

Gen CuZn-SOD penyandi superoksida dismutase yang diisolasi dari tanaman Melastoma malabathricum L. telah berhasil diintroduksikan ke dalam genom tanaman tembakau dan padi. Namun sampai saat ini analisis protein yang diekspresikan belum dilakukan karena belum adanya antibodi spesifik untuk MmCuZnSOD. Pembuatan Antibodi MmCuZnSOD dapat dilakukan dengan memasukkan protein MmCuZnSOD kedalam tubuh hewan. Namun, kandungan protein ini pada tanaman sangat rendah, sehingga protein ini sulit diisolasi dan dipurifikasi dari tanaman. Hal ini dapat diatasi dengan melakukan ekspresi protein MmCuZnSOD secara berlebih di dalam sel bakteri Escherichia coli. Tujuan penelitian ini adalah mengkonstruksi vektor ekspresi untuk gen MmCuZnSOD dan mengekspresikan secara berlebih untuk memproduksi protein antigen. Penelitian dimulai dari konstruksi vektor ekspresi pET-14b-CuZnSOD yang membawa gen MmCuZnSOD dan vektor tersebut diintroduksi ke dalam E. coli strain Rosetta (DE3) sebagai sel inang. Optimasi ekspresi protein dilakukan dengan penentuan konsentrasi IPTG (0.1 mM, 0.3 mM, 0.5 mM dan 1 mM), lama waktu induksi (2 jam, 4 jam, 6 jam dan 8 jam) dan suhu (30 oC dan 37 oC) optimum. Analisis protein dilakukan dengan fraksinasi protein untuk memisahkan fraksi insoluble dan soluble dengan enzim lisosim dan sonikasi. Protein MmCuZnSOD dipurifikasi menggunakan kromatografi afinitas Ni-NTA dan elektroelusi protein. Protein hasil pemurnian diendapkan menggunakan aseton. Pada penelitian ini gen MmCuZnSOD berhasil disisipkan ke dalam vektor pET-14b. Verfikasi dilakukan dengan PCR koloni menggunakan primer T7 dan SOD-R menghasilkan amplikon yang berukuran 609 pb yang sesuai dengan ukuran dari daerah promoter sampai multiple cloning site (150 pb) dan gen MmCuZnSOD (459 pb). Pemotongan dengan enzim restriksi NdeI dan EcoRI menghasilkan dua pita DNA berukuran 4152 pb dan 978 pb. Pengurutan urutan DNA menunjukkan bahwa gen ini telah berfusi dengan penyandi His-tag pada ujung N-terminal. Berdasarkan hasil optimasi ekspresi,kondisi optimumuntuk sintesis protein MmCuZnSOD adalahkonsentrasi IPTG 0.5 mM dengan induksi selama enam jam pada suhu 37oC.Analisis lebih lanjut menggunakan SDS-PAGE menunjukkan bahwa protein MmCuZnSOD yang telah berfusi dengan 6x histidin memiliki ukuran 15 kDa dan terdapat pada kedua fraksi solubledaninsoluble. Analisis western blot dengan anti-histidin menunjukkan bahwa protein rekombinan MmCuZnSOD berhasil dipurifikasi dari fraksi insoluble dalam kondisi denaturasi dengan 8M urea menggunakan kromatografi afinitas Ni-NTA. Purifikasi dengan metode elektroelusi menghasilkan protein dengan kemurnian tinggi tetapi dalam konsentrasi rendah sehingga dilakukan pengendapan menggunakan aseton dengan konsentrasi aseton 50%. Protein murni yang dihasilkan adalah sebesar 3.75 mg dari 350 mL kultur sel.