Isolation and Cloning of cDNA Fragment of Gene Encoding for Steroid Nuclear Receptor Protein from Melastoma malabathricum L.

Abstract

We have isolated a cDNA fragment of gene encoding for Steroid Nuclear Receptor protein from Melastoma malabathricum L. (MmFSNR). Started by successfully total RNA isolation, we then generated total cDNA using total RNA as template by reverse transcription. The fragment of MmFSNR (700bp) had been isolated by PCR using total cDNA as template and specific primers snrF and snrR. The MmFSNR fragment was succesfully inserted into pGEM®–T Easy plasmid, then the recombinant plasmid was introduced into Eschericia coli DH5α. Sequencing of MmFSNR fragment using ABI Prism 310 Automated DNA sequencer resulted sequence of 700bp of MmFSNR fragment. The MmFSNR fragment does not contain EcoR1 restriction site founded in the multi cloning site of pGEM®–T Easy. Alignment analysis of nucleotide using BLASTN showed that the MmFSNR fragment is 65% identical to cDNA fragment encoding for uncharacterized membran protein of Arabidopsis thaliana (At3g27390), identical to (GN : At3g27390; Uniprot :Y3739_ARATH). Alignment analysis of deduced amino acid showed that MmFSNR protein is 53% identical to At3g27390 protein and 47% identical to SNR protein of Medicago truncantula. At3g27390 is a protein induced by flagellin elicited by pathogen and SNR is protein related to xenobiotic sensor.

Respon tanaman terhadap senyawa xenobiotik baik yang berasal dari biotik maupun abiotik melibatkan sejumlah mekanisme pertahanan yang spesifik dan terkoordinasi. Inisiasi respon selulernya dilakukan oleh reseptor xenobiotik yang berperan mendeteksi senyawa dan menginduksi beragam aktivitas enzimatik dan transporter untuk mendetoksifikasi dan menghilangkan senyawa asing. Steroid nuclear receptor, adalah bagian dari kelas reseptor inti (Nuclear receptors/NRs). NR adalah faktor transkripsi yang diaktivasi oleh ligan yang mengatur ekspresi gen melalui interaksi dengan sekuen DNA hulu dari gen-gen targetnya dan merupakan sensor xenobiotik. Protein ini juga mempunyai fungsi sebagai sensor pertahanan terhadap patogen dalam sistem imunitas tanaman. Fragmen cDNA dari gen penyandi protein Steroid Nuclear Receptor dari Melastoma malabathricum. L (MmFSNR) telah berhasil diisolasi dan diklon di dalam pGEM®–T Easy. Isolasi dan pengklonan MmFSNR dimulai dengan RNA total. RNA total telah berhasil diisolasi. cDNA total telah berhasil disintesis dengan menggunakan RNA total sebagai cetakan melalui proses transkripsi balik. Fragmen cDNA MmFSNR berukuran 700 pb telah berhasil diisolasi melalui PCR dengan cDNA total sebagai cetakan dan primer spesifik snrF dan snrR. Fragmen MmFSNR ini kemudian diinsersikan kedalam plasmid pGEM®–T Easy, selanjutnya plasmid rekombinan ini diintroduksikan ke dalam Eschericia coli DH5α. Pengurutan DNA fragmen MmFSNR dengan menggunakan ABI Prism 310 Automated DNA Sequencer menghasilkan urutan fragmen cDNA MmFSNR sebesar 700 pb. Fragmen ini mengandung beberapa situs enzim restriksi tetapi tidak mengandung situs pemotongan EcoR1 yang terdapat di dalam situs ganda pengklonan dari pGEM®–T Easy. Analisis kesejajaran nukleotida menggunakan program BLASTN menunjukkan bahwa fragmen MmFSNR mempunyai kemiripan 65% dengan mRNA penyandi protein membran uncharacterized dari Arabidopsis thaliana L. (At3g27390). Analisis penyejajaran deduksi asam amino dari fragmen MmFSNR menggunakan program BLASTP menunjukkan bahwa protein deduksi dari cDNA MmFSNR mempunyai kemiripan 53% dengan protein At3g27390 dan 47% dengan SNR dari Medicago truncantula. At3g27390 adalah protein yang diinduksi oleh elisitor flagelin yang dihasilkan oleh patogen dan SNR adalah sensor xenobiotik, sehingga MmFSNR kemungkinan mempunyai peranan dalam detoksifikasi Al yang dapat menjadi senyawa xenobotik.