Fusi Protoplas Interspesies Antara Jeruk Siam Simadu (Citrus nobilis Lour.) dengan Mandarin Satsuma (C. unshiu Marc.)

Abstract

Somatic hybridization is an important tool for supplying new varieties to be used directly as cultivar genetic improvement programs. In citrus, this technology has been extensively used and has many important implipications. The objectives to the research are produceed citrus somatic hybrids between citrus siam Simadu and Mandarin Satsuma with chemical fusion (PEG). Protoplasts of siam Simadu from calli with Mandarin Satsuma from mesophyll-derived protoplasts were regenerated by somatic embryogenesis. Concentration and duration of incubation in a solution of PEG strongly affected the fusion induction of siam Simadu with Mandarin Satsuma. High concentrations of PEG can increase the frequency of fusion, while the low concentration produces a low frequency of fusion. The result showed that protoplasts from embryogenic callus of Simadu tangerine and in vitro leaf of Mandarin Satsuma can be isolated in large numbers by using a combination of cellulase Onozuka R10, Yakult Yakult% 1% with R10 Maserozim in CPW solution. Protoplasts are purified with a mixture of 25% sucrose with 13% mannitol. Protoplast density produced from embryogenic callus is 15.7x105 protoplasts / g callus and 13x105 protoplasts/ g in vitro leaf. The concentration of PEG used to induce fusion between mesophyll protoplasts Mandarin Satsuma and siam Simadu callus affect the average number of protoplasts fusion. Average number of protoplasts were fused by using PEG 4% are 3.3 hetero fusion, 5.0 homo fusion and multi-fusion. Average number of protoplasts were fused by using PEG 30% are 4.7 hetero fusion, 6.7 homo fusion 6.7 and 7.7multi-fusion. The success of fusan regeneration on regeneration medium is influenced by PEG concentration used for induction of fusion. Protoplasts were fused with PEG only 4%, which can regenerate to form cell walls, making cell division, colony cells, micro-callus and somatic embryo. Protoplasts were fused with PEG 30% can only be regenerated to form the cell wall and cell division. Giving light to the culture after 2 weeks may accelerate cell division that can form colonies of cells. Dilutions of cell suspension with the same medium (without 2, 4-D) can accelerate the growth and development of the protoplasts formed colonies of cells, micro-callus and somatic embryos. MW medium is best used in the fusion because it can encourage of somatic embryos directly. Addition of ABA 0.5 mg / l in the media can produce somatic embryos and GA3 0.5 mg / l can germinate mature somatic embryos to plantlets with 76% germination efficiency. Somatic hybrids were germinated, then trasfered to a medium culture, and finally grafted in greenhouse. The hybrids were confirmed by growth of in vitro culture, morphology, cytology (chromosome number), molecular analysis (ISSR), and contain of chlorophyl Keywords: Citrus, male sterility, chemical fusion, somatic embryogenesis, morphology,

Kebutuhan pasar dunia secara global akan buah jeruk yang dikonsumsi segar saat ini dan masa mendatang adalah perlu memenuhi kategori buah yang tidak berbiji (seedless), mudah dikupas (easy peeling) dan mempunyai tipe mandarin dengan warna yang menarik (pigmented). Jeruk siam Pontianak dan Simadu adalah dua dari jenis jeruk batang atas komersial (scion) yang banyak dikenal di Indonesia. Akan tetapi kedua jenis jeruk tersebut masih mempunyai biji yang relatif banyak (15-21 biji per buah) dan warna (pigmented) belum begitu menarik sehingga kalah bersaing dengan jeruk produk negara lain. Untuk menghindari tekanan buah jeruk impor tersebut maka diperlukan sentuhan inovasi teknologi terhadap jeruk lokal tersebut untuk meningkatkan kualitas buah sehingga dapat diterima dan bersaing di pasar global. Untuk mendapatkan tanaman jeruk yang mempunyai karakter buah seedless pada tanaman jeruk sudah dimulai dilakukan beberapa dekade yang lalu melalui pemuliaan konvensional. Mandarin Satsuma (C. unshiu Marc.) adalah merupakan jenis jeruk yang secara alami mempunyai sifat seedless dan telah terbukti bahwa sifat seedless yang terdapat pada jeruk Mandarin Satsuma disebabkan oleh polennya yang steril (male sterility) yang biasa disebut dengan istilah MS. Untuk memindahkan sifat MS tersebut dari jeruk Mandarin Satsuma kepada jeruk siam sangat sulit dilakukan melalui pemuliaan konvensional karena adanya faktor genetik (inkompaitble). Oleh karena itu perlu dicari cara lain untuk memindahkan sifat seedless dari jeruk Mandarin Satsuma ke jeruk siam. Konsentrasi dan lama inkubasi dalam larutan PEG sangat berpengaruh terhadap induksi fusi protoplas tanaman. Konsentrasi PEG yang tinggi dapat meningkatkan frekuensi fusi protoplas sedangkan konsentrasi yang rendah menghasilkan frekuensi fusi yang rendah. Dari hasil penelitian yang telah dilakukan diperoleh bahwa kombinasi enzim selulase Onozuka (R-10 Yakult) 1% dengan maserozim (R-10-Yakult) 1% dalam larutan CPW dapat mengisolasi protoplas sebanyak 13.9 x 105 protoplas/gram dari mesofil daun dan 15.1 x 105 protoplas/g dari kalus embriogenik. Semakin lama waktu inkubasi dalam larutan PEG maka semakin banyak jumlah protoplas yang mengalami fusi baik PEG konsentrasi tinggi (30%) maupun konsentrasi rendah (4%). Penggunaan induksi PEG 30% lebih efektif untuk menginduksi terjadinya fusi dari pada 4%. Tipe fusi yang dihasilkan adalah hetero fusi, homo fusi, dan multi fusi. Rata-rata jumlah hetero fusi yang dihasilkan dari fusi yang diinduksi dengan PEG 30% adalah 1.6 dari inkubasi 5 menit, 3.6 dari inkubasi 10 menit dan 4.8 dari inkubasi 15 menit. Rata-rata jumlah hetero fusi yang dihasilkan dari hasil fusi menggunakan PEG 4% adalah 1.2 dari inkubasi 5 menit, 1.8 dari inkubasi 10 menit dan 3.0 dari inkubasi 15 menit. Frekuwensi fusi meningkat setelah penambahan 200 μl larutan pencuci. Ratara-rata jumlah heterofusi dari induksi PEG 30% menjadi 7.2 dan 3.6 dari induksi fusi PEG 4%. Protoplas dari kalus embriogenik jeruk siam Simadu dan daun in vitro jeruk Mandarin Satsuma dapat diisolasi dalam jumlah yang banyak menggunakan kombinasi enzim selulase Onozuka R10- Yakult 1% dengan Maserozim R10-Yakult 1% dalam larutan CPW yang dimurnikan dengan campuran sukrosa 25% dengan manitol 13%. Densitas protoplas yang dihasilkan dari kalus embriogenik adalah 15.7x105 protoplas/g kalus dan 13.0x105 protoplas/g daun. Konsentrasi PEG yang digunakan untuk menginduksi fusi protoplas dari kalus jeruk siam Simadu dengan protoplas mesofil daun in vitro berpengaruh terhadap jumlah rata-rata protoplas berfusi yang dihasilkan. Rata-rata jumlah total protoplas berfusi menggunakan PEG 4% adalah 3.3 hetero fusi, 5 homo fusi dan multi fusi sedangkan menggunakan PEG 30% adalah 4.7 hetero fusi, 6.7 homo fusi dan 7.7 multi fusi. Keberhasilan regenerasi protoplas hasil fusi pada media kultur yang digunakan dipengaruhi oleh konsentrasi PEG yang dipakai untuk menginduksi terjadinya fusi. Hanya protoplas yang difusikan dengan PEG 4% yang dapat beregenerasi membentuk dinding sel, melakukan pembelahan sel, koloni sel, mikro kalus dan embrio somatik, sedangkan protoplas yang difusikan dengan PEG 30% hanya dapat beregenerasi membentuk dinding sel dan pembelahan sel. Pemberian cahaya pada kultur setelah umur 2 minggu dapat mempercepat pembelahan sel sehingga dapat membentuk koloni-koloni sel. Pengenceran suspensi sel dengan media kultur yang sama (tanpa 2,4-D) dapat mempercepat pertumbuhan dan perkembangan protoplas membentuk koloni sel, mikro kalus dan embrio somatik. Media kultur MW merupakan media yang paling baik digunakan dalam kultur protoplas hasil fusi karena dapat menginduksi terjadinya embriogensis somatik secara langsung. Penambahan ABA 0.5 mg/l dalam media dapat mendewasakan embrio somatik dan GA3 0.5 mg/l dapat mengecambahkan embrio somatik dewasa sehingga diperoleh plantlet. Berdasarkan pertumbuhan hasil keragaan kultur in vitro pada media tumbuh yang selektif (MW+EM 500 mg/l) diperoleh 5 kandidat hibrida somatik dari 19 regeneran yang diuji. Evaluasi lebih lanjut dengan marka molekuler ISSR menggunakan primer ISSR8 diperoleh 4 hibrida somatik dari 5 kandidat yang diuji. Jumlah kromosom dari hibrida somatik yang diperoleh merupakan penjumlahan dari jumlah kromosom kedua tetuanya (36 pasang) kecuali R10 dengan jumlah kromosom 35 pasang. Warna, tulang, dan kandungan kloropil daun dari hibrida somatik merupakan intermediet dari kedua tetuanya.