Induksi Prosuduksi Seskuiterpen pada Kultur Suspensi Kalus Aquilaria malaccensis Lamk dengan Elisitor

Abstract

Aquilaria malaccensis Lamk adalah salah satu spesies tanaman penghasil gaharu yang tersebar di sejumlah pulau di Indonesia. Spesies ini termasuk ke dalam Apendiks II CITES sebagai spesies rentan punah. Di sisi lain, produksi yang rendah dan permintaan yang tinggi di pasar global membuat gaharu dihargai dengan nilai tinggi. Oleh karena itu, teknik produksi resin gaharu yang cepat dan berkelanjutan penting untuk dikembangkan. Gaharu terbentuk sebagai respons pertahanan terhadap cekaman biotik atau abiotik. Resin gaharu tersusun atas beragam senyawa, terutama dari golongan seskuiterpen dan kromon. Resin gaharu disintesis dalam jumlah kecil, gaharu dengan kandungan resin tinggi terbentuk dalam waktu hingga puluhan tahun. Sejumlah teknologi induksi gaharu telah diterapkan pada tanaman budidaya. Namun demikian, prosesnya tetap membutuhkan waktu relatif lama. Produksi metabolit sekunder melalui teknik kultur in vitro dapat menjadi cara alternatif untuk memproduksi resin gaharu. Teknik kultur suspensi sel dan suspensi kalus telah digunakan untuk memproduksi metabolit sekunder penting, namun penerapan teknik ini untuk produksi minyak esensial masih menghadapi banyak tantangan, terutama rendemen yang rendah. Elisitasi kultur menggunakan hormon pertahanan seperti asam salisilat (SA) dan metil jasmonat (MeJA), atau komponen sel patogen berpotensi menginduksi produksi seskuiterpen terkait resin gaharu. Penelitian ini terdiri atas beberapa tahap, yaitu 1) induksi kalus dan induksi kultur suspensi kalus, 2) analisis kinetika pertumbuhan dan analisis metabolomik pada kultur suspensi kalus, 3) analisis profil metabolomik pada kultur suspensi kalus pada 3 tingkat konsentrasi metil jasmonat (MeJA) dan asam salisilat (SA), serta 1 konsentrasi ekstrak kasar Fusarium oxysporum (CeFo), dan 4) analisis ekspresi gen HMGR, FPS, dan SesTPS1 pada 6 dan 12 jam setelah perlakuan elisitor. Induksi kalus dari eksplan daun dilakukan pada media dasar MS yang ditambah auksin dan sitokinin berdasarkan penelitian terdahulu. Kalus yang diperoleh digunakan sebagai inokulum untuk induksi kultur suspensi kalus. Komposisi media suspensi sama dengan media induksi kalus tanpa pemadat. Kalus hasil induksi kultur suspensi kalus selama 2 minggu digunakan sebagai inokulum untuk kultur suspensi kalus pada pengamatan kurva pertumbuhan dan perlakuan elisitor. Analisis kinetika pertumbuhan pada kultur suspensi dilakukan selama 28 hari. Kalus dipanen setiap 4 hari, berat basah ditimbang, dikeringkan, kemudian berat kering ditimbang. Biomassa kering halus diekstrak menggunakan n-heksana, dikering angin, dielusi menggunakan diklorometan, disaring, kemudian dianalisis menggunakan GC-MS untuk mengkarakterisasi struktur profil metabolomik. Waktu dan durasi elisitasi ditentukan berdasarkan kurva pertumbuhan yang diperoleh pada penelitian dan studi literatur. Untuk analisis ekspresi gen, sampel dipanen pada 6 dan 12 jam setelah perlakuan elisitor dari batch berbeda. Analisis ekspresi gen dilakukan dengan teknik qPCR menggunakan tiga ulangan biologis dan dua ulangan teknik. Pada penelitian ini dihasilkan kalus dengan karakteristik kalus agak meremah, berwarna krem, dan sedikit berair. Analisis kinetika pertumbuhan menunjukkan bahwa kurva pertumbuhan kalus pada kultur suspensi membentuk pola sigmoid. Fase pertumbuhan eksponensial terjadi antara 0 dan 8 HSI, diikuti oleh fase puncak pada 12 HSI. Fase stasioner terjadi antara 16 dan 20 HSI, diikuti oleh fase kematian pada 24 HSI. Pada 0 dan 16 HSI, metabolomik didominasi oleh asam lemak. Pada 20 hingga 28 HSI, kultur cenderung memproduksi fitosterol, hidrokarbon, dan aldehid. Kromon terdeteksi secara fluktuatif pada konsentrasi rendah. Perlakuan 3 tingkat konsentrasi elisitor MeJA dan SA, maupun ekstrak kasar F. oxysporum masing-masing tidak memicu akumulasi seskuiterpen, namun perlakuan elisitor (termasuk kontrol) memicu perubahan profil metabolomik. Senyawa 6-methoxy-2-phenethyl-4H-chromen-4-one terdeteksi pada kultur dengan atau tanpa elisitor, sedangkan 6-methoxy-2-(4-methoxyphenethyl)-4H-chromen-4-one) terdeteksi di hampir semua sampel dengan perlakuan elisitor dan 2-phenethyl-4H-chromen-4-one hanya terdeteksi pada perlakuan 50 µM MeJA. Perlakuan elisitor meningkatkan ekspresi HMGR setelah 6 jam, kecuali pada perlakuan 75 µM SA. Hanya perlakuan CeFo yang meningkatkan ekspresi gen HMGR secara signifikan 6 jam setelah elisitasi. Pada elisitor MeJA dan SA, ekspresi gen HMGR tertinggi dihasilkan pada perlakuan 50 µM MeJA (5,5 kali) dan 50 µM SA (3,5 kali). Setelah 12 jam, perlakuan elisitor tidak meningkatkan ekspresi gen HMGR secara nyata. Perlakuan elisitor MeJA dan SA tidak meningkatkan ekspresi FPS secara nyata, baik pada 6 maupun 12 jam setelah perlakuan. Ekspresi gen FPS meningkat secara signifikan setelah 6 jam pada perlakuan CeFo, kemudian menurun drastis setelah 12 jam. Ekspresi gen SesTPS1 meningkat antara 1,65 hingga 6,36 kali lipat dibandingkan dengan kontrol pada 6 jam setelah elisitasi. Ekspresi gen SesTPS1 tertinggi pada masing-masing jenis elisitor diperoleh pada perlakuan 12,5 µM MeJA (6,36 kali) dan 50 µM SA (5,6 kali), serta 3,8 kali lipat pada perlakuan CeFo. Setelah 12 jam, ekspresi SesTPS1 pada semua perlakuan lebih rendah dari kontrol, terutama pada konsentrasi SA yang lebih tinggi.