| dc.description.abstract | Penelitian ini secara umum bertujuan untuk menghasilkan genotipe ubi kayu yang toleran terhadap kerusakan fisiologis pasca panen (Postharvest Physiological Deterioration/PPD) dengan masa simpan lebih panjang dibandingkan tipe liarnya, melalui penerapan teknologi genome editing CRISPR/Cas9 yang menargetkan gen MeSGT1 (pengkode enzim scopoletin-glucosyltransferase). Penelitian dibagi menjadi tiga topik utama untuk mencapai tujuan tersebut. Topik pertama bertujuan mengembangkan protokol induksi embrio somatik dan friable embryogenic callus (FEC) yang efektif pada genotipe ubi kayu Indonesia sebagai langkah awal yang krusial sebelum transformasi genetik. Penelitian ini menguji pengaruh jenis auksin (2,4-D 10 mg l-1 dan pikloram 12 mg l-1) dan jenis eksplan (tunas aksilar, leaf lobe, daun, batang, tangkai daun) untuk induksi embrio somatik pada ubi kayu genotipe Menti, Manggu dan Nangka, serta penambahan L-tirosin terhadap keberhasilan FEC pada genotipe Menti dan Carvita25. Hasilnya menunjukkan bahwa eksplan tunas aksilar pada media dengan pikloram 12 mg l-1 merupakan metode paling efektif, dengan genotipe Menti menghasilkan hingga 202,3 embrio somatik per 10 eksplan. Hasil induksi FEC, menunjukkan bahwa respons terhadap L-tirosin bersifat spesifik genotipe. Carvita25 memerlukan L-tirosin 500 µM, 60444 (kontrol) optimal tanpa L-tirosin, sedangkan Menti kurang responsif sehingga memerlukan eksplorasi faktor lain. Protokol ini menjadi fondasi teknis bagi transformasi genetik ubi kayu di Indonesia. Topik kedua bertujuan mentransformasikan konstruk plasmid CRISPR/Cas9 yang menargetkan gen MeSGT1 ke dalam genom ubi kayu menggunakan eksplan FEC, serta meregenerasi tanaman T0 hasil penyuntingan yang akan dikarakterisasi lebih lanjut. Transformasi dilakukan dengan menginokulasi FEC genotipe model 60444 menggunakan Agrobacterium tumefaciens LBA4404 yang membawa vektor pYLCRISPR/ Cas9p35s-HygR, dilanjutkan dengan seleksi bertahap menggunakan higromisin (5–15 mg l-1) dan regenerasi menjadi plantlet. Transformasi pada 36 kluster FEC menghasilkan 59 tanaman T0 putatif dengan tingkat efisiensi transformasi mencapai 5,4%. Analisis PCR menggunakan primer gen ketahanan higromisin (hpt) mengonfirmasi 14 tanaman positif membawa transgen. Amplifikasi PCR pada daerah target gen MeSGT1 menghasilkan pola pita ganda pada beberapa galur, yang mengindikasikan terjadinya mutasi kimera akibat penyuntingan gen MeSGT1 melalui mekanisme Non-Homologous End Joining (NHEJ). Tanaman hasil penyuntingan berhasil diaklimatisasi di rumah kaca dengan tingkat keberhasilan 60% dan menunjukkan pertumbuhan vegetatif yang tidak berbeda signifikan dengan tanaman tipe liar. Topik ketiga bertujuan mengkarakterisasi profil fenotipe (morfologi umbi), parameter biokimia (kandungan skopoletin), serta marka molekuler (profil transkriptom) pada umbi ubi kayu hasil editing gen MeSGT1 untuk mengevaluasi ketahanannya terhadap PPD. Karakterisasi dilakukan pada 8 galur hasil editing (T02, T03, T04, T06, T07, T08, T09, T016) dan kontrol wildtype 60444. Hasil morfologi menunjukkan variasi antar T0, dengan T02 dan T03 memiliki ketahanan PPD tertinggi (luas perubahan warna < 5% pada 24 jam), berbeda nyata dengan T0 rentan yang mencapai > 50%. Analisis LCMS menunjukkan bahwa T02 berhasil menekan akumulasi skopoletin hingga hanya 12,8% dari kontrol pada 24 jam setelah panen, sesuai target penyuntingan, sedangkan galur T06 mengalami peningkatan 4,5 kali lipat akibat dugaan off-target mutation. Analisis transkriptomik pada T03 sebagai kandidat T0 tahan PPD mengidentifikasi 108 gen yang mengalami perubahan ekspresi (56 up-regulated, 52 down-regulated). Analisis Gene Ontology dan KEGG mengungkap bahwa mutasi MeSGT1 memengaruhi jalur respons terhadap stres oksidatif (pengikatan heme/tetrapyrrole), metabolisme fenilpropanoid (biosintesis skopoletin/skopolin), serta metabolisme sianogenik glukosida (linamarin/lotaustralin). Rekomendasi mengarah pada T02 dan T03 sebagai kandidat potensial untuk pengembangan varietas ubi kayu tahan PPD. Secara keseluruhan, ketiga tahapan penelitian ini telah berhasil membangun alur kerja yang terintegrasi dan sistematis, mulai dari pengembangan protokol induksi embrio somatik dan FEC pada genotipe ubi kayu Indonesia, transformasi CRISPR/Cas9 yang menargetkan gen MeSGT1, hingga karakterisasi fenotipe, biokimia, dan molekuler umbi hasil penyuntingan. Keberhasilan induksi FEC pada genotipe Carvita25 dengan penambahan L-tirosin 500 µM dan pada 60444 tanpa L-tirosin menunjukkan bahwa optimalisasi media harus dilakukan secara spesifik per genotipe. Transformasi yang berhasil menghasilkan tanaman T0 dengan bukti awal terjadinya mutasi kimera pada gen MeSGT1, dibuktikan dengan pola pita ganda pada PCR serta efisiensi transformasi 5,4%. Karakterisasi lebih lanjut membuktikan bahwa T02 dan T03 mampu menekan akumulasi skopoletin hingga 12,8% dari kontrol dan memperlambat luasan PPD hingga kurang dari 5% pada 48 jam setelah panen, sementara T06 menunjukkan peningkatan skopoletin 4,5 kali lipat yang tidak diinginkan. Penelitian ini tidak hanya berhasil menghasilkan kandidat T0 ubi kayu tahan PPD (T02 dan T03) yang berpotensi dikembangkan lebih lanjut, tetapi juga menyediakan protokol transformasi dan media induksi FEC yang dapat diadopsi untuk perbaikan genotipe lokal ubi kayu Indonesia lainnya di masa depan. | |
