Introduksi Gen Lipase Bakteri Termofilik Aneurinibacillus thermoaerophilus D2B ke Komagataella phaffii

Abstract

Lipase merupakan enzim yang menghidrolisis trigliserida menjadi asam lemak dan gliserol, serta banyak digunakan dalam industri. Aplikasinya yang luas pada bidang industri mendorong peningkatan kebutuhan produksi lipase dalam skala besar dengan karakteristik biokimia yang dapat mempertahankan aktivitas dan stabilitas dalam kondisi industri. Lipase dari mikroorganisme menjadi salah satu sumber potensial, contohnya bakteri termofilik seperti Aneurinibacillus thermoaerophilus yang menghasilkan lipase D2B. Selain itu, mikroorganime juga dimanfaatkan secara luas sebagai sistem ekspresi untuk produksi lipase heterolog, salah satunya Komagataella phaffii. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan mengonstruksi gen lipase D2B ke dalam K. phaffii, yang dipilih karena sistem ekspresi ekstraselulernya efektif untuk produksi skala besar. Konstruksi dilakukan melalui amplifikasi dan restriksi pGEM-T_d2b serta plasmid pPIC9K menggunakan EcoRI dan NotI, diikuti ligasi (insert:vektor = 3:1) dan transformasi ke Escherichia coli DH5a menghasilkan 7 klon positif berukuran ± 1600 bp. Plasmid kemudian dilinearisasi dengan SacI, ditransformasikan ke K. phaffii, dan klon putatif diverifikasi menggunakan primer AOX1 serta kombinasi primer AOX1 dan d2b_pPIC9K. Hasil menunjukkan gen lipase D2B berhasil diintegrasikan ke dalam genom K. phaffii melalui rekombinasi homolog. Rekombinasi homolog ditunjukkan dari ukuran amplikon yang terbentuk, yaitu 2,2 kb dan 1,6 kb, 1,5 kb, serta 1,2 kb.

Lipase is an enzyme that hydrolyzes triglycerides into fatty acids and glycerol, and is widely used in industry. Its wide application in the industrial field is driving the increasing need for large-scale lipase production with biochemical characteristics that can maintain activity and stability under industrial conditions. Lipase from microorganisms is one of the potential sources, for example thermophilic bacteria such as Aneurinibacillus thermoaerophilus that produce D2B lipase. In addition, microorganisms are also widely used as an expression system for the production of heterologous lipases, one of which is Komagataella phaffii. Therefore, this study aimed to construct the D2B lipase gene into K. phaffii, which was chosen because its extracellular expression system is effective for large-scale production. Construction was carried out through amplification and restriction of pGEM-T_d2b and pPIC9K plasmids using EcoRI and NotI, followed by ligation (insert:vector = 3:1) and transformation to Escherichia coli DH5a produced 7 positive clones measuring ± 1600 bp. The plasmid was then legalized with SacI, transformed into K. phaffii, and the putative clone was verified using AOX1 primers as well as a combination of AOX1 and d2b_pPIC9K primers. The results showed that the D2B lipase gene was successfully integrated into the genome of K. phaffii through homologous recombination. Homologous recombination is shown from the size of the amplicon formed, namely 2.2 kb and 1.6 kb, 1.5 kb, and 1.2 kb.