Mutasi Terarah Q516H dan L480M Gen Pengkode Glukosa Oksidase untuk Rekonstruksi Plasmid Rekombinan pPICZaB-GOX-Xho

Abstract

Glukosa oksidase merupakan enzim flavoprotein asal Aspergillus niger yang mengkatalisis oksidasi ß-D-glukosa dengan spesifitas tinggi. Penelitian ini bertujuan melakukan rekonstruksi plasmid rekombinan pPICZaB-GOX-Xho dengan mutasi titik Q516H dan L480M. Metode yang digunakan meliputi perancangan sepasang primer mutagenik secara in silico, isolasi plasmid pPICZaB GOX-Xho, PCR site-directed mutagenesis, serta transformasi plasmid produk PCR ke dalam sel kompeten E. coli DH5a melalui metode kejut panas. Hasil penelitian mununjukkan isolasi plasmid menghasilkan konsentrasi DNA sebesar 133,035 ng/µL dengan rasio kemurnian A260/280 1,86. Situs mutasi menggunakan primer spesifik Q516H dan L480M dengan posisi mismatch pada bagian tengah. Keberhasilan transformasi plasmid pPICZaB-GOX-Xho Q516H dibuktikan oleh tumbuhnya koloni pada media selektif mengandung zeocin 25 µg/mL, dengan hasil isolasi plasmid transforman sebesar 31,277 ng/µL dan pita tunggal pada elektroforesis gel agarosa. Transformasi pPICZaB-GOX-Xho Q516H/L480M belum berhasil menumbuhkan koloni yang diharapkan akibat rendahnya efisiensi PCR dan penurunan viabilitas sel kompeten.

Glucose oxidase is a flavoprotein enzyme from Aspergillus niger that catalyzes the oxidation of ß-D-glucose with high specificity. This study aimed to reconstruct the pPICZaB-GOX-Xho with point mutations Q516H dan L480M. The methods used included the in silico design of a pair of mutagenic primers, isolation of the pPICZaB-GOX-Xho plasmid, PCR site-directed mutagenesis, and transformation of the PCR products plasmids into E. coli DH5a competent cells via the heat shock method. The results of study showed that plasmid isolation yielded a DNA concentration of 133.035 ng/µL with an A260/280 1,86. The mutation sites were introduced using specific primers Q516H and L480M with a mismatch in the middle. The success of plasmid transformation pPICZaB-GOX-Xho Q516H plasmid was confirmed by the growth of colonies on selective medium containing 25 µg/mL zeocin, with a plasmid yield of 31.277 ng/µL and a single on agarose gel electrophoresis. Transformation of the pPICZaB-GOX-Xho Q516H/L480M plasmid did not result in the expected colony growth due to low PCR efficiency and reduced competent cell viability.