Analisis Genomik dan Mekanisme Toleransi Timbal (Pb) oleh Bakteri Indigenus asal Danau Kaolin, Belitung, Indonesia

Abstract

Timbal (Pb) adalah salah satu logam berat yang diklasifikasikan sebagai zat beracun bahkan dalam jumlah sangat kecil dan tidak memiliki manfaat biologis bagi makhluk hidup. Unsur ini bersifat persisten di lingkungan karena tidak dapat terdegradasi secara alami serta cenderung terakumulasi pada tumbuhan, hewan, dan organisme akuatik di berbagai tingkat rantai makanan. Toksisitas timbal dapat berpotensi menimbulkan dampak gangguan kesehatan serius pada manusia akibat paparan jangka panjang. Timbal dapat memasuki ekosistem alami melalui proses alami dan aktivitas manusia, terutama pada sektor industri. Oleh karena itu, diperlukan penanggulangan pencemaran yang efektif dan ramah lingkungan, salah satunya melalui pemanfaatan mikroorganisme. Mikroba yang berasal dari lokasi tercemar sangat berpotensi untuk mendetoksifikasi pencemaran logam berat karena jenis mikroba ini memungkinkan untuk memiliki fenotipe toleran terhadap paparan logam berat. Kondisi tersebut menunjukkan bahwa kajian mengenai mekanisme toleransi mikroba terhadap timbal relevan untuk dikembangkan guna menunjang strategi penanggulangan pencemaran yang efektif dan berkelanjutan. Isolat bakteri Bacillus cereus RDK1 dan Burkholderia cenocepacia RDK8 sebelumnya telah diisolasi dari area bekas pertambangan timah di danau Kaolin, Belitung, Indonesia. Isolat tersebut menunjukkan secara fenotip toleran terhadap 100 ppm Pb(NO3)2 yang mengindikasikan potensinya sebagai agen bioremediasi pencemaran timbal. Namun, pemahaman mengenai mekanisme toleransi isolat ini masih belum diketahui, sehingga hal ini membatasi potensi aplikasinya sebagai agen bioremediator. Studi ini bertujuan untuk mengetahui kemampuan toleransi tertinggi diantara kedua isolat, mengidentifikasi gen-gen yang berperan dalam mekanisme toleransi, serta mengevaluasi beberapa mekanisme toleransi yang teramati secara fenotipik. Metode penelitian dilakukan dalam beberapa tahapan, dimulai dari analisis toleransi kedua isolat bakteri tersebut terhadap Pb(NO3)2 pada konsentrasi 100 hingga 500 ppm, menentukan nilai Minimum Inhibitory Concentration (MIC) dan Minimum Bactericidal Concentration (MBC), mengukur sisa timbal dengan Atomic Absorption Spectroscopy (AAS), pembentukan biofilm dengan metode Crystal Violet 0,1% dan aktivitas siderofor menggunakan Crome Azurol S (CAS). Biosorpsi timbal pada sel bakteri yang dikonfirmasi melalui analisis Transmission Electron Microscopy-Energy Dispersive X-Ray Spectroscopy (TEM-EDS) dan Scanning Electron Microscopy (SEM). Analisis sekuens genom melalui Whole Genom Sequencing (WGS) juga dilakukan untuk memberikan pemahaman yang komprehensif mengenai mekanisme yang mendasari ketahanan bakteri terhadap logam berat. Hasil penelitian menunjukkan bahwa B. cenocepacia RDK8 dapat bertahan pada konsentrasi Pb(NO3)2 yang lebih tinggi dibandingkan dengan B. cereus RDK1, dengan MIC sebesar 2.500 ppm dan MBC sebesar 10.000 ppm. Analisis AAS mengonfirmasi kemampuan kedua isolat dalam menyerap timbal, dengan hasil persentase efisiensi yang lebih tinggi pada B. cenocepacia RDK8, yaitu sebesar 68,81% pada konsentrasi Pb(NO3)2 300 ppm dan 62,89% pada 500 ppm. Oleh karena itu, B. cenocepacia RDK8 diidentifikasi sebagai isolat paling efektif dalam penelitian ini. Urutan genom lengkap RDK8 diperoleh menggunakan platform MGI DNBSEQ. Analisis seluruh genom mengidentifikasi gen kunci dan jalur metabolisme yang berpotensi terlibat dalam toleransi terhadap timbal seperti gen-gen yang terlibat dalam efluks, kelatasi, exopolysaccharide (EPS)/biofilm, dan proteksi stres oksidatif sebagai respon terhadap cekaman timbal. Temuan gen kunci didukung oleh kemampuan fenotipik. Aktivitas positif siderofor pada media agar CAS menunjukkan kemampuan sel dalam mengikat timbal. Selain itu, terjadi penurunan produksi biofilm seiring dengan peningkatan konsentrasi timbal, dari kategori kuat pada kelompok kontrol menjadi negatif pada konsentrasi 10.000 ppm. Pengamatan morfologi sel menggunakan SEM menunjukkan perubahan pada struktur permukaan setelah terpapar timbal. Analisis TEM-EDS menunjukkan distribusi timbal secara dominan di tepi sel yang terasosiasi dengan struktur dinding sel. Lokalisasi ini mengindikasikan adanya mekanisme sekuestrasi ekstraseluler atau periplasmik. Temuan ini menegaskan potensi genetik dan aksi B. cenocepacia RDK8 sebagai bakteri potensial toleran timbal. Berdasarkan hasil tersebut, B. cenocepacia RDK8 menunjukkan fenotipe toleran terhadap stres Pb(NO3)2. Integrasi analisis genomik dengan beberapa karakteristik fenotipik mengungkapkan bahwa B. cenocepacia RDK8 memiliki potensi mekanisme toleransi timbal. Temuan ini menunjukkan bahwa kombinasi kapasitas fisiologis dan potensi genetik mendukung penggunaan B. cenocepacia RDK8 sebagai kandidat yang unggul dalam bioremediasi lingkungan yang terkontaminasi timbal.

Lead (Pb) is a heavy metal classified as a toxic substance even in very small amounts and has no biological benefit for living organisms. This substance is persistent in the environment because it does not degrade naturally and tends to accumulate in plants, animals, and aquatic organisms at various levels of the food chain. Lead toxicity can potentially cause serious health disorders in humans as a result of long-term exposure. Lead can enter natural ecosystems through both natural processes and human activities, primarily in the industrial sector. Therefore, effective and environmentally friendly pollution control is required, one of which involves utilizing microorganisms. Indigenous microbes from polluted sites have great potential to detoxify heavy metal contamination, as these types of microbes are likely to have tolerant phenotypes against heavy metal exposure. This condition indicates that studies on the mechanisms of microbial tolerance to lead are relevant for development to support effective and sustainable pollution control strategies. The bacterial isolates Bacillus cereus RDK1 and Burkholderia cenocepacia RDK8 were previously isolated from a former tin mining area in Kaolin Lake, Belitung, Indonesia. These isolates phenotypically exhibited tolerance to 100 ppm Pb(NO3)2, indicating their potential as bioremediation agents for lead pollution. However, understanding of the tolerance mechanisms in these isolates is still lacking, thereby limiting their application potential as bioremediators. The aim of this study is to determine the highest tolerance level among the two isolates, identify the genes involved in the tolerance mechanism, and evaluate several tolerance mechanisms observed phenotypically. The research methods were carried out in several stages, starting from analyzing the tolerance of both bacterial isolates to Pb(NO3)2 at concentrations from 100 to 500 ppm, determining the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and Minimum Bactericidal Concentration (MBC), measuring residual lead using Atomic Absorption Spectroscopy (AAS), biofilm formation using the 0.1% Crystal Violet method, and siderophore activity using Chrome Azurol S (CAS). Specific lead biosorption on bacterial cells was confirmed through Transmission Electron Microscopy-Energy Dispersive X-ray Spectroscopy (TEM-EDS) and Scanning Electron Microscopy (SEM) analyses. Genomic sequence analysis via Whole Genome Sequencing (WGS) was also conducted to provide a comprehensive understanding of the underlying mechanisms of bacterial resistance to heavy metals. The results shaowed that B. cenocepacia RDK8 could withstand higher concentrations of Pb(NO3)2 compared to B. cereus RDK1, with an MIC of 2,500 ppm and an MBC of 10,000 ppm. AAS analysis confirmed the ability of both isolates to absorb lead, with higher percentage efficiency in B. cenocepacia RDK8, namely 68.81% at a Pb(NO3)2 concentration of 300 ppm and 62.89% at 500 ppm. Therefore, B. cenocepacia RDK8 was identified as the most effective isolate in this study. The complete genome sequence of RDK8 was obtained using the MGI DNBSEQ platform. Whole-genome analysis identified key genes and metabolic pathways potentially involved in lead tolerance, such as genes related to efflux, chelation, exopolysaccharide (EPS)/biofilm formation, and oxidative stress protection in response to lead stress. The presence of key genes was supported by phenotypic capabilities. Positive siderophore activity on CAS agar medium indicated the cell’s ability to bind lead. In addition, biofilm production decreased with increasing lead concentration, from strong in the control group to negative at 10,000 ppm. Cell morphology observations using SEM showed changes in surface structure after exposure to lead. TEM-EDS analysis shows that lead is predominantly distributed at the cell edges, associated with the cell wall structure. This localization indicates the presence of an extracellular or periplasmic sequestration mechanism. These findings confirm the genetic potential and action of B. cenocepacia RDK8 as a potential lead-tolerant bacterium. Based on these results, B. cenocepacia RDK8 exhibits a tolerant phenotype towards Pb(NO3)2 stress. The integration of genomic analysis with phenotypic characteristics reveals that B. cenocepacia RDK8 possesses strong lead tolerance mechanisms. These findings indicate that the combination of physiological capacity and genetic potential supports the use of B. cenocepacia RDK8 as a superior candidate for bioremediation of environments contaminated by lead.