Kloning Dan Transformasi Gen Human Fibroblast Growth Factor-2 (FGF-2) Pada Agrobacterium tumefeciens GV3101

Abstract

Protein Human Fibroblast Growth Factor-2 (FGF-2) berfungsi sebagai regulator dalam mekanisme proliferasi, diferensiasi dan migrasi sel. Aktivitas biologisnya untuk mensintesis kolagen dan regenerasi tulang. Tingginya biaya produksi rekombinan human FGF-2 mendorong pengembangan sistem ekspresi rekombinan yang lebih terjangkau. Optimalisasi produksi protein human FGF-2 dapat dicapai menggunakan teknik kloning molekular menggunakan vektor ekspresi dengan variasi posisi His-tag. Strategi ini menempatkan posisi His-tag pada ujung gen yaitu pada ujung 5' dan 3'. Desain variasi posisi His-tag bertujuan untuk menghasilkan protein dengan label N-terminal dan C-terminal, serta mengevaluasi efisiensi translasi dan stabilitas protein. Penelitian ini bertujuan untuk mengkonstruksi dua vektor ekspresi gen human FGF-2 dilengkapi dengan His-tag N-terminal dan C-terminal dan ditransformasikan pada Agrobacterium tumefaciens GV3101. Evaluasi lanjutan dari konstruksi gen human FGF-2 akan menentukan posisi His-tag yang optimal dalam produksi rekombinan human FGF-2. Penelitian ini berhasil mengklon gen human FGF-2 dengan His-tag N-terminal dan C-terminal pada masing-masing ujung 5' dan 3' ke dalam vektor pTA2. Konfirmasi keberhasilan kloning dibuktikan melalui digesti enzim restriksi NdeI dan SacI pada plasmid rekombinan N1 (pTA-N6His-FGF2) dan C1 (pTA2-FGF2-C6His). Verifikasi dilanjutkan dengan analisis sekuen trasngen menggunakan metode Sanger sequencing. Hasil skuensing menunjukkan fragmen sepanjang 498 bp dari transgen human FGF-2. Analisis BLASTn terhadap sekuens tersebut menghasilkan nilai e-value 0,0 dan identitas 100%. Hasil ini mengonfirmasi keakuratan sekuen sisipan gen human FGF-2 beserta His-tagnya pada kedua konstruk. Selanjutnya sisipan gen human FGF-2 beserta His-tagnya disebut N6His-FGF2 untuk posisi His-tag pada ujung 5' dan FGF2-C6His untuk posisi His-tag pada ujung 3' dari gen human FGF-2 pada plasmid pTA2. Hasil subklon N6His-FGF2 dan FGF2-C6His ke dalam vektor ekspresi pRI-101-AN menghasilkan plasmid rekombinan N1 (pRI-101-AN-N6His-FGF2) dan C1 (pRI-101-AN-FGF2-C6His). Digesti enzim NdeI dan SacI mengonfirmasi keberhasilan subkloning dengan pita DNA berukuran ? 500 bp sebagai vektor ekspresi gen human FGF-2. Keberhasilan transformasi vektor ekspresi ke dalam A. tumefaciens GV3101 dikonfirmasi menggunakan teknik PCR koloni dengan primer spesifik gen human FGF-2. Hasil penelitian ini membuktikan keberhasilan konstruksi vektor ekspresi gen human FGF-2 dengan His-tag pada N-terminal dan C-terminal. Agrobacterium yang telah membawa vektor ekspresi rekombinan akan digunakan untuk analisis ekspresi sementara pada tembakau dengan metode agroinfiltrasi.

Human Fibroblast Growth Factor-2 (FGF-2) serves as a pivotal regulator in the mechanisms of cellular proliferation, differentiation, and migration. The biological activities of human FGF-2 are essential for collagen synthesis and bone regeneration. The prohibitive cost of commercial recombinant human FGF-2 has necessitated the development of more affordable recombinant expression systems. The optimization of human FGF-2 production can be achieved through molecular cloning techniques using expression vectors with variable polyhistidine (His)-tag positioning. This strategy involves integrating the His-tag at the 5' and 3' termini of the gene to generate proteins with N-terminal and C-terminal labels, respectively, facilitating the evaluation of translational efficiency and protein stability. This study aimed to construct two human FGF-2 expression vectors featuring N-terminal and C-terminal His-tags and subsequently transformed them into Agrobacterium tumefaciens GV3101. Future evaluations of these constructs will determine the optimal His-tag orientation for maximizing recombinant human FGF-2 yield. In this study, the human FGF-2 gene was successfully cloned with N-terminal and C-terminal His-tags at the 5' and 3' ends, respectively, into the pTA2 vector. Cloning success was validated via restriction digestion using NdeI and SacI enzymes on recombinant plasmids N1 (pTA-N6His-FGF2) and C1 (pTA2-FGF2-C6His). Verification was further conducted using Sanger sequencing, which identified a 498 bp fragment of the human FGF-2 transgene. BLASTn analysis of the sequence yielded an E-value of 0.0 and 100% identity, confirming the sequence fidelity of the human FGF-2 insert and its respective His-tags in both constructs. Subsequently, the N6His-FGF2 and FGF2-C6His inserts were subcloned from the pTA2 plasmid into the pRI-101-AN expression vector, resulting in recombinant plasmids N1 (pRI-101-AN-N6His-FGF2) and C1 (pRI-101-AN-FGF2-C6His). Restriction digestion with NdeI and SacI confirmed successful subcloning, indicated by a DNA band of approximately 500 bp. The successful transformation of these expression vectors into Agrobacterium tumefaciens GV3101 was confirmed via colony PCR using human FGF-2-specific primers. These results demonstrate the successful construction of human FGF-2 expression vectors with N-terminal and C-terminal His-tags. The engineered Agrobacterium strains will be utilized for transient expression analysis in tobacco via the agroinfiltration method.