Biosorpsi Merkuri oleh Khamir Saccharomyces cerevisiae dan Ekspresi Gen pada Khamir Terkait Detoksifikasi Merkuri

Abstract

Kontaminasi merkuri (Hg) teridentifikasi pada berbagai kompartemen lingkungan dan rantai makanan, terutama dalam bentuk metilmerkuri pada hasil laut, produk konsumsi, serta komoditas dari wilayah dengan paparan merkuri endemik. Akumulasi senyawa ini menimbulkan risiko serius terhadap kesehatan manusia dan mengganggu stabilitas ekosistem. Berbagai metode remediasi fisika dan kimia telah dikembangkan, namun efektivitasnya terbatas dan berpotensi menghasilkan produk samping toksik. Oleh karena itu, penanganan merkuri diarahkan ke teknologi bioremediasi sebagai alternatif yang lebih ramah lingkungan. Khamir Saccharomyces cerevisiae digunakan dalam penelitian ini karena status keamanannya (Generally Recognized as Safe, GRAS), ketahanan fisiologis terhadap logam berat dan metaloid, serta karakter genetik yang mendukung mekanisme detoksifikasi merkuri. Penelitian ini mengevaluasi respons toleransi, kapasitas biosorpsi, dan akumulasi Hg oleh S. cerevisiae BY4741, serta mengaitkan respons fenotipik dengan jalur molekuler yang terlibat dalam efluks ion logam, homeostasis redoks, dan respons antioksidan. Oleh karena itu, tujuan penelitian meliputi: (i) menentukan batas toleransi dan dinamika pertumbuhan S. cerevisiae pada paparan HgCl2, (ii) mengamati viabilitas sel dan penyerapan konsentrasi Hg terlarut pasca-inkubasi, (iii) memetakan akumulasi dan distribusi Hg pada biomassa, serta (iv) memprofilkan ekspresi gen YCF1, YAP1, GSH1, dan URE2 yang diasosiasikan dengan detoksifikasi logam dan stres oksidatif. Analisis bioinformatika pada skala genom digunakan untuk mengaitkan hasil eksperimental dengan lintasan Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) dan Gene Ontology (GO). Penelitian diawali dengan meremajakan dan mengamati morfologi khamir secara mikroskopis untuk memastikan kemurnian isolat dalam penyimpanan ampul freeze-drying. Uji toleransi HgCl2 terdiri atas spot assay, uji total plate count (TPC), kurva pertumbuhan, dan laju pertumbuhan spesifik (µ). Anotasi fungsional genom dilakukan melalui pemetaan KEGG/GO. Ekspresi transkripsi gen ditentukan dengan RT-qPCR menggunakan Act1 sebagai gen referensi dan analisis kelipatan relatif (2^–??CT). Konsentrasi Hg terlarut diukur pada 24 dan 48 jam menggunakan atomic absorption spectroscopy (AAS). Akumulasi dan distribusi spasial Hg pada biomassa dinilai dengan micro X-ray fluorescence (µ-XRF). Secara morfologi, S. cerevisiae memiliki koloni bulat, putih, tidak tembus cahaya (opaque), cembung (convex), tepian halus, dan permukaan koloni yang mengilap. Sel S. cerevisiae BY4741 tampak oval/bulat telur, terdiri atas sel tunggal dan sel bertunas. Secara fenotipik, S. cerevisiae mempertahankan viabilitas hingga paparan 100 ppm HgCl2, sedangkan pada 200–300 ppm pertumbuhan terhambat total. Pada rentang 0–100 ppm, jumlah koloni menurun seiring kenaikan konsentrasi Hg, yang menunjukkan adanya korelasi negatif antara konsentrasi merkuri dan kelangsungan hidup sel. Viabilitas S. cerevisiae OD600 menunjukkan kultur kontrol mencapai densitas akhir 17.763, sedangkan 100 ppm 11.883, dan pada 200 ppm tidak terjadi peningkatan berarti. Nilai OD yang dilaporkan merupakan nilai setelah dikalikan dengan faktor pengenceran. Estimasi MIC untuk HgCl2 yaitu lebih dari 100 ppm, dengan µ tertinggi pada kontrol, dilanjutkan 100 ppm, dan mendekati nol pada 200 ppm. Pemetaan KEGG/GO menempatkan respons terhadap Hg sebagai kombinasi regulasi transkripsi, efluks/sekuestrasi logam, detoksifikasi enzimatik, serta aktivitas antioksidan. Analisis fungsional menunjukkan YCF1, YAP1, GSH1, dan URE2 merupakan gen yang terlibat dalam mekanisme detoksifikasi logam berat termasuk merkuri. Paparan merkuri (Hg) secara signifikan menginduksi transkripsi gen keempat gen tersebut. URE2 menunjukkan kenaikan tertinggi (7,8 kali pada 100 ppm), merefleksikan tingginya aktivitas antioksidan. YCF1 meningkat pada kedua dosis yang terkait aktivitas pemompaan konjugat logam-GSH ke vakuola. YAP1 dan GSH1 meningkat pada paparan sedang lalu menurun pada paparan lebih tinggi, kemungkinan disebabkan oleh mekanisme umpan balik/penekanan di bawah stres tinggi dan diduga akibat terganggunya keseimbangan homeostasis redoks. Pengukuran AAS memperlihatkan penurunan kadar Hg terlarut setelah 24 jam inkubasi, dengan efisiensi penghilangan logam 49,13%. Pada 48 jam, kadar Hg meningkat kembali dan efisiensi menurun menjadi 34,95%. Pola ini menunjukkan kemampuan penghilangan Hg tertinggi berada fase pertumbuhan aktif, kemudian berkurang setelah mencapai titik kesetimbangan saat kultur memasuki fase stasioner. Analisis µ-XRF mengonfirmasi akumulasi Hg pada biomassa. Pemetaan intensitas menunjukkan distribusi yang tidak homogen, sementara analisis kuantitatif mendeteksi kelimpahan Hg sebesar 0,16% pada perlakuan dan tidak ditemukan pada kontrol. Pada penelitian ini diketahui batas toleransi S. cerevisiae pada 100 ppm HgCl2 yang masih diikuti pertumbuhan, ekspresi gen yang bergantung dosis, serta analisa kuantitatif penghilangan Hg maksimal pada periode 24 jam dan bergeser menurun pada 48 jam. Kombinasi AAS dan µ-XRF memberikan informasi efisiensi penghilangan Hg yang berkaitan dengan waktu inkubasi dan fase pertumbuhan khamir, serta informasi akumulasi Hg pada biomassa. Secara aplikatif, S. cerevisiae layak dieksplorasi sebagai kandidat bioremediasi berbasis khamir dengan memanfaatkan properti genetik seperti, efluks/transpor (YCF1), regulasi stres oksidatif (YAP1, URE2), dan redoks/glutation (GSH1) sebagai target dalam optimasi proses.

Kata kunci: Bioakumulasi, glutation, logam berat, merkuri, Saccharomyces cerevisiae

NURUL AZMA. Mercury Biosorption by the Yeast Saccharomyces cerevisiae and the Expression of Genes Related to Mercury Detoxification. Supervised by RIKA INDRI ASTUTI and WULAN TRI WAHYUNI S. Mercury (Hg) contamination is widely detected across the environment, particularly in consumer products such as food and cosmetics, posing cumulative risks to human health and ecosystem stability. Physical and chemical remediation technologies have been developed, but these methods have certain limitations. They often offer relatively low efficiency in reducing Hg concentrations, produce toxic by-products, and incur high operational costs. Bioremediation provides a more sustainable alternative and comprehensive approach to mitigating mercury contamination. Saccharomyces cerevisiae is well-suited for this purpose due to its Generally Recognized as Safe (GRAS) status, physiological resilience to metals and metalloids, and a genetic toolkit that supports targeted process optimization. In this study, the tolerance response, decontamination capacity, and mercury (Hg) accumulation of S. cerevisiae BY4741 were evaluated, and the observed phenotypes were linked to molecular pathways involved in metal-ion efflux, redox homeostasis, and antioxidant responses. Therefore, the objectives of this research were to: (i) determine tolerance limits and growth dynamics under HgCl2 exposure, (ii) assess cell viability and uptake of dissolved Hg after incubation, (iii) investigate Hg accumulation and its spatial distribution in biomass, and (iv) profile the expression of YCF1, YAP1, GSH1, and URE2 genes associated with metal detoxification and oxidative stress. Genome-scale bioinformatic analysis was performed to contextualize experimental findings using the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) and Gene Ontology (GO). The study began with rejuvenation and microscopic observation of yeast morphology to ensure the purity of the isolate stored in the freeze-dried ampoule. Tolerance to HgCl2 was assayed in graded concentrations using a spot assay, followed by total plate counts (TPC). Growth was monitored over 54 hours by measuring the optical density (OD600) every 3 hours to estimate the specific growth rate (µ). Functional genome annotation used KEGG/GO mapping. RT-qPCR quantified transcript levels with Act1 as the reference gene and relative fold-change analysis (2^–??CT). Dissolved Hg was measured at 24 and 48 h using atomic absorption spectroscopy (AAS). Hg accumulation and its spatial distribution in biomass were evaluated by micro–X-ray fluorescence (µ-XRF). Morphologically, the colonies of S. cerevisiae were circular, white, opaque, convex, with smooth margins and a glossy surface. S. cerevisiae cells appeared oval/elliptical, comprising single cells and budding cells. Phenotypically, S. cerevisiae maintained viability up to 100 ppm HgCl2, whereas growth was fully inhibited at 200–300 ppm. Across 0–100 ppm, colony counts declined with increasing Hg concentration, indicating a negative relationship between mercury levels and viable cells. OD600 measurements showed a final density of 17.763 in controls, 11.883 at 100 ppm, with no meaningful increase at 200 ppm. The estimated MIC for HgCl2 was greater than 100 ppm, with the highest µ in controls, lower at 100 ppm, and near zero at 200 ppm, supporting the presence of a clear tolerance threshold and an adaptation phase before resumed growth under moderate exposure. KEGG/GO mapping indicated that the cellular response to mercury stress is mediated by a combination of transcriptional regulation, metal ion transport (efflux), sequestration, enzymatic detoxification, and antioxidant activity, aiming to minimize Hg toxicity. Functional analysis identified YCF1, YAP1, GSH1, and URE2 as mercury-sensitive genes essential for the cellular detoxification of heavy metals. Mercury exposure significantly induced the transcription of all the genes. URE2 showed the highest increase (7.8-fold at 100 ppm), consistent with enhanced antioxidant capacity. YCF1 increased at both doses, aligning with the pumping of Hg-glutathione conjugates into the vacuole. YAP1 and GSH1 increased at moderate exposure and declined at higher exposure, plausibly reflecting feedback/attenuation under high stress and disruption in redox homeostasis. AAS revealed a decrease in dissolved Hg after 24 h of incubation, with a removal efficiency of 49.13%. At 48 h, dissolved Hg increased, and efficiency declined to 34.95%. This pattern indicates maximal removal during active growth, followed by attenuation as equilibrium is approached and cultures enter the stationary phase. Biological controls showed no detectable Hg, indicating that the decrease in concentration is likely due to yeast-mediated biosorption. µ-XRF confirmed Hg accumulation in biomass, with intensity mapping appearing homogeneous for bulk preparations. Quantitative estimates indicated 0.16% Hg in treated samples and 0% in controls. In this study, Saccharomyces cerevisiae exhibited tolerance to 100 ppm HgCl2, characterized by sustained growth, a dose-dependent transcriptional response, and a time-dependent maximum removal at 24 h, which diminished by 48 h. The combined application of AAS and µ-XRF provided complementary insights into mercury removal efficiency in relation to incubation time and yeast growth phase, as well as mercury accumulation within the biomass. Practically, S. cerevisiae demonstrates potential as a yeast-based bioremediation candidate, leveraging its genetic properties associated with efflux/transport (YCF1), oxidative stress regulation (YAP1, URE2), and redox/glutathione metabolism (GSH1) as key targets for process optimization.

Keywords: bioaccumulation, glutathione, heavy metals, mercury, Saccharomyces cerevisiae