Ekspresi Gen Virulensi Vibrio parahaemolyticus dan Imunitas Udang Vaname yang Dipelihara dalam Sistem Bioflok dengan Penambahan Probiotik
Abstract
Budidaya udang mengalami berbagai kendala yang menyebabkan kerugian ekonomi, salah satunya disebabkan oleh penyakit bakterial. Acute hepatopancreatic necrotic disease (AHPND) adalah penyakit yang menyerang udang vaname yang disebabkan oleh bakteri V. parahaemolyticus. Patogenisitas V. parahaemolyticus diatur melalui mekanisme quorum sensing (QS) yang diregulasi oleh regulator QS diantaranya gen opaR dan aphA. Selain itu, V. parahaemolyticus juga diketahui memiliki faktor virulensi dan juga toksin yang menyebabkan AHPND yaitu T6SS1, T6SS2, dan pirB. Oleh sebab itu, diperlukan langkah strategis untuk mengontrol populasi dan menurunkan faktor virulensi V. parahaemolyticus, sekaligus meningkatkan imunitas dan resistansi udang terhadap infeksi V. parahaemolyticus. Alternatif yang dapat dilakukan untuk menurunkan virulensi bakteri patogen, meningkatkan ekspresi gen imunitas dan respons imun, serta resistansi udang terhadap infeksi V. parahaemolyticus adalah melalui aplikasi bioflok dengan penambahan probiotik. Bioflok mampu memodifikasi keragaman mikrobiota pada saluran pencernaan udang dan media pemeliharaan, serta berperan sebagai biokontrol bakteri patogen melalui suatu mekanisme, salah satunya quorum sensing (QS). Penambahan probiotik pada sistem bioflok mampu meningkatkan respons imun udang, kinerja pertumbuhan, kualitas media budidaya, keanekaragaman mikrobiota baik di media budidaya maupun di tubuh udang, menghambat pertumbuhan bakteri patogen, sehingga dapat meningkatkan resistansi udang vaname terhadap infeksi bakteri patogen. Hasil penelitian sebelumnya menunjukkan dampak positif dari aplikasi bioflok dan probiotik dalam meningkatkan respons imun udang, kualitas media pemeliharaan, dan resistansi udang terhadap patogen.
Penelitian ini bertujuan mengevaluasi ekspresi gen virulensi V. parahaemolyticus dan imunitas udang vaname yang dipelihara dalam sistem bioflok dengan penambahan probiotik Pseudoalteromonas piscicida 1Ub dan diuji tantang dengan V. parahaemolyticus. Hewan uji yang digunakan yaitu udang vaname (Penaeus vannamei) stadia juvenil dengan bobot rata-rata 1,31 ± 0,001 g yang dipelihara dalam akuarium selama 21 hari dengan volume teknis 30 L dan padat tebar 1 ekor L-1. Pemeliharaan udang dibagi menjadi dua perlakuan yaitu kontrol dan uji tantang menggunakan V. parahaemolyticus dengan kepadatan 105 CFU mL-1 yang merupakan hasil dari uji lethal concentration 50 (LC50). Penelitian aplikasi bioflok dan probiotik pada udang vaname ini menggunakan rancangan acak lengkap dengan 8 perlakuan dan 3 ulangan. Kontrol terdiri dari kontrol negatif (K-), kontrol bioflok (KB), kontrol probiotik (KPro), dan kontrol bioflok + probiotik (KBPro). Perlakuan uji tantang meliputi kontrol positif (K+), bioflok (B), probiotik (Pro), dan bioflok + probiotik (BPro). Perlakuan bioflok menggunakan perbandingan rasio C:N 10. Selama perlakuan, udang diberi pakan komersial dengan kadar protein 39-40% sebanyak 5 kali sehari (pukul 06.00, 10.00. 14.00, 18.00, dan 22.00) serta diberikan secara at restricted dengan feeding rate 8% dari bobot biomassa udang. Analisis ekspresi gen dilakukan dengan mengambil sampel air pemeliharaan (virulensi) dan hepatopankreas udang (imunitas). RNA bakteri diekstraksi menggunakan GENEzol TriRNA Bacteria Kit (Geneaid, Taiwan) menyesuaikan dengan prosedur pengerjaan. Selanjutnya, konsentrasi RNA total diukur menggunakan Nanodrop 2000 (Thermo Scientific, USA). Sintesis complementary deoxyribonucleic acid (cDNA) dilakukan menggunakan RevertAid first strand cDNA synthesis kit (Thermo Scientific, US) sesuai dengan prosedur pengerjaan. Ekspresi gen diukur menggunakan real-time quantitative PCR (qPCR) dengan satu gen housekeeping. Primer yang digunakan disesuaikan dengan masing-masing gen, kemudian dilakukan PCR menggunakan Appplied Biosystem StepOne (Thermo Fisher, US) dan kit SensiFAST SYBR® Hi-ROX (Bioline, Inggris). Volume hasil reaksi adalah 20 µL. Amplifikasi qPCR sesuai dengan referensi masing-masing gen yang digunakan. Parameter yang diukur dan diamati yaitu ekspresi gen virulensi V. parahaemolyticus, ekspresi gen imunitas udang vaname, respons imun (total hemocyte count (THC), aktivitas fagositosis (AF), aktivitas phenoloxidase (PO), dan aktivitas respiratory burst (RB)), kinerja pertumbuhan (tingkat kelangsungan hidup, perubahan bobot, dan laju pertumbuhan spesifik (LPS)), serta parameter kualitas air.
Aplikasi bioflok dengan penambahan probiotik P. piscicida 1Ub dapat menurunkan ekspresi dan regulator QS dan faktor virulensi V. parahaemolyticus secara signifikan dibandingkan dengan kontrol positif (P<0,05). Hasil ekspresi gen opaR dan aphA menunjukkan tren yang sama pada setiap perlakuan. Faktor virulensi T6SS1 menurun secara signifikan dengan pengaplikasian kombinasi antara bioflok dan probiotik, sedangkan pada ekspresi T6SS2 tidak menunjukkan hasil yang berbeda signifikan (P<0,05). Aplikasi bioflok menurunkan ekspresi toksin PirB secara signifikan, namun pada perlakuan lainnya tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan dengan kontrol positif (P<0,05). Ekspresi gen terkait imunitas pada udang juga terlihat mengalami peningkatan secara signifikan dengan penambahan suspensi bioflok dan probiotik P. piscicida 1Ub (P<0,05). Seluruh perlakuan mengalami peningkatan secara signifikan pada ekspresi gen lipopolysaccharide and beta-1,3-glucan (LGBP) (P<0,05). Ekspresi gen prophenoloxidase (proPO) meningkat signifikan pada perlakuan kontrol probiotik dan bioflok yang diuji tantang, sedangkan pada perlakuan lainnya tidak menunjukkan hasil yang berbeda signifikan (P<0,05). Perlakuan kontrol bioflok, probiotik dan kombinasi keduanya pada ekspresi gen serine protease (SP) memiliki nilai yang berbeda signifikan dengan perlakuan yang diuji tantang (P<0,05). Ekspresi gen peroxinectin (PE) meningkat signifikan pada seluruh perlakuan baik kontrol maupun uji tantang dibandingkan dengan kontrol positif (P<0,05). Parameter respons imun (THC, RB, PO, dan AF), kelangsungan hidup, performa pertumbuhan, dan parameter kualitas air pada aplikasi bioflok, probiotik, dan kombinasi keduanya juga memiliki nilai yang relatif lebih tinggi dibandingkan kontrol positif (P<0,05). Penelitian ini menunjukkan bahwa aplikasi bioflok, probiotik, dan kombinasi keduanya mampu menurunkan ekspresi gen regulator QS dan faktor virulensi V. parahaemolyticus, memodulasi ekspresi gen imunitas serta meningkatkan resistansi udang vaname terhadap infeksi V. parahaemolyticus. Hasil terbaik ditunjukkan pada perlakuan kombinasi bioflok dan probiotik.
Collections
- MT - Fisheries [3019]