Kloning dan Karakterisasi Lipase-Fosfolipase Thraustochytrids pada E. coli BL.21 (DE3)

Abstract

Lipase-fosfolipase merupakan enzim multifungsi yang menggabungkan peran lipase dan fosfolipase dalam satu protein yang ditemukan pada thraustochytrids. Enzim ini ditemukan pada Aurantiochytrium limacinum yang berperan penting dalam kompetisi mikroba serta perolehan asam lemak dari lingkungan. Kemampuan enzim yang unik memiliki potensi untuk pengaplikasian lebih luas terutama dalam industri bioteknologi. Informasi detail terkait enzim dibutuhkan untuk efisiensi dalam pemanfaatannya. Penelitian ini bertujuan untuk mengkloning gen lipase-fosfolipase ke E. coli BL21 (DE3) dan mengkarakterisasi enzim lipase-fosfolipase dengan metode spektrofotometri dan titrasi. Gen lipase-fosfolipase dari thraustochytrids dikloning pada vektor ekspresi pET28a yang ditransformasi ke E. coli BL21 (DE3). Koloni E. coli BL21 yang terkonfirmasi membawa gen target diuji secara kualitatif menggunakan agar plate dengan substrat lesitin dan tributirin. Setelah ekspresi heterolog, enzim lipase-fosfolipase mampu menghidrolisis substrat tributirin dan lesitin pada agar plate. E. coli BL21 rekombinan yang memiliki aktivitas pada uji kualitatif digunakan untuk menghasilkan ekstrak kasar enzim. Lipase-fosfolipase diekspresikan secara intraseluler. Ekstrak enzim digunakan untuk karakterisasi enzim berdasarkan suhu, pH, substrat preferensi lipase dan fosfolipase. Enzim memiliki karakteristik biokimia optimal pada suhu 50 °C, pH 9,5, preferensi substrat lipase yaitu p-nitrofenil laurat (112,8 U/mL) yang termasuk asam lemak bebas rantai sedang dengan aktivitas spesifik lipase 10,26 U/mg, dan preferensi substrat fosfolipase yaitu fosfatidilserin (1149,3 U/mL) dengan aktivitas spesifik 104,48 U/mL. Aktivitas spesifik enzim fosfolipase 10 kali lebih besar dari aktivitas spesifik lipase. Penelitian awal menunjukkan bahwa enzim lipase-fosfolipase berhasil dikloning pada E. coli BL21 (DE3) dan enzim memiliki karakteristik dengan suhu tinggi, pH basa, dan karakteristik spesifik substrat yang variatif.