Seleksi Bakteri Rizosfer Nanas Simadu Subang untuk Akumulasi Asam Indol-3-asetat pada Media Tanpa Penambahan Triptofan

Abstract

Akumulasi asam indol-3-asetat atau indole-3-acetic acid (IAA) oleh kultur bakteri umumnya memerlukan penambahan triptofan pada media kultur sehingga biaya produksi menjadi lebih tinggi. Kemampuan bakteri dalam memproduksi IAA pada media kultur tanpa penambahan triptofan (jalur triptofan independen) perlu diseleksi. Potensi bakteri tersebut didasarkan pada ukuran dan berat buah tanaman nanas Simadu Subang yang lebih besar dibandingkan tanaman nanas Subang lainnya dikarenakan adanya peran bakteri tersebut dalam menyediakan IAA. Penelitian ini bertujuan untuk menyeleksi isolat bakteri rizosfer nanas Simadu Subang yang mampu memproduksi IAA di media kultur pada jalur triptofan independen dan meningkatkan akumulasinya dengan variasi pH media dan suhu. Penelitian dimulai dengan melakukan uji hemolisis pada sepuluh isolat bakteri rizosfer nanas Simadu Subang. Bakteri yang tidak bersifat patogen dikultivasi pada media LB tanpa penambahan L-triptofan untuk menyeleksi kemampuan akumulasi IAA. Satu isolat bakteri dengan akumulasi IAA terbaik dibuat kurva tumbuh. Identifikasi keseluruhan genom (whole genome sequencing) dilakukan untuk melihat gen yang terlibat dalam biosintesis IAA. Keberadaan klaster gen yang terlibat jalur triptofan independen dikonfirmasi dengan menganalisis metabolit yang terdeteksi pada LC-MS/MS. Perbandingan akumulasi IAA dikedua jalur dilihat dengan mengkultivasi kultur bakteri di media LB pada berbagai tingkat konsentrasi L-triptofan. Peningkatan akumulasi IAA pada biosintesis jalur triptofan independen dilakukan dengan merekayasa metabolisme bakteri dengan faktor pH media dan suhu kultur. Isolat M7 merupakan bakteri yang tidak bersifat patogen dan mampu menghasilkan konsentrasi IAA tertinggi pada media tanpa penambahan L-triptofan. Keseluruhan genom bakteri ini telah diidentifikasi dan memiliki setidaknya lima gen yang terlibat dalam biosintesis IAA melalui jalur yang tidak dipengaruhi keberadaan L-triptofan atau jalur triptofan independen. Keberadaan gen tersebut dikonfirmasi oleh akumulasi metabolit yang dihasilkan gen dalam biosintesis IAA melalui jalur triptofan independen. Akumulasi IAA tertinggi pada kultur ini adalah 98 µg/mL pada medium LB tanpa penambahan L-triptofan setelah 48 jam kultivasi pada suhu 30°C dan pH 7,0. Akumulasi IAA ini lebih besar dibandingkan pada kultur dengan penambahan 600 µg/mL L-triptofan. Produksi IAA oleh kultur bakteri ini dapat lebih dominan melalui jalur triptofan independen dibandingkan dengan jalur melalui triptofan dependen sehingga dapat disimpulkan bahwa kultur sel M7 dapat menghasilkan IAA tanpa adanya penambahan L-triptofan.

The accumulation of indole-3-acetic acid (IAA) by bacterial cultures generally requires the addition of tryptophan to the culture media so that production costs are higher. The ability of bacteria to produce IAA in culture media without the addition of tryptophan (tryptophan-independent pathway) needs to be selected. The potential of these bacteria is based on the size and weight of the fruit of the Simadu Subang pineapple plant which is greater than other Subang pineapple plants due to the role of these bacteria in providing IAA. This research aims to select isolates of Simadu Subang pineapple rhizosphere bacteria that are capable of producing IAA in culture media using a tryptophan-independent pathway and increasing its accumulation by varying media pH and temperature. The research began by conducting hemolysis tests on ten isolates of Simadu Subang pineapple rhizosphere bacteria. Non-pathogenic bacteria were cultivated in LB media without the addition of L-tryptophan to select the ability to accumulate IAA. One bacterial isolate with the best IAA accumulation was made into a growth curve. Identification of the whole genome sequencing was carried out to look at the genes involved in IAA biosynthesis. The existence of tryptophan-independent pathway involved gene clusters was confirmed by analyzing metabolites detected on LC-MS/MS. The comparison of IAA accumulation in both pathways was seen by cultivating bacterial cultures in LB media at various L-tryptophan concentration levels. Increasing the accumulation of IAA in the tryptophan-independent pathway was carried out by engineering bacterial metabolism with the factors of media pH and culture temperature. Isolate M7 is a non-pathogenic bacterium and can produce the highest concentration of IAA in media without the addition of L-tryptophan. The entire genome of this bacterium has been identified and contains at least five genes involved in IAA biosynthesis through a pathway that is not affected by the presence of tryptophan or a tryptophan-independent pathway. The existence of the gene was confirmed by the accumulation of metabolites produced by the gene in IAA biosynthesis via a tryptophan-independent pathway. The highest IAA accumulation in this culture was 98 µg/mL in LB medium without the addition of L-tryptophan after 48 hours of cultivation at 30°C and pH 7.0. This IAA accumulation was greater than in cultures with the addition of 600 µg/mL L-tryptophan. Production of IAA by this bacterial culture can be more dominant through the tryptophan- independent pathway compared to the tryptophan-dependent pathway, so it can be concluded that the M7 cell culture can produce IAA without the addition of L-tryptophan.