Isolasi dan Potensi Bakteriofage untuk Pengendalian Infeksi Vibrio parahaemolyticus pada Udang Vaname
Date
2024-05Author
Takwin, Bagus Ansani
Wahjuningrum, Dinamella
Widanarni, Widanarni
Metadata
Show full item recordAbstract
Vibrio parahaemolyticus yang menghasilkan toxin PirA dan PirB
merupakan agen penyebab penyakit acute hepatopancreatic necrosis disease yang
menyebabkan kematian massal hingga 100% udang di tambak. Pengendalian
penyakit bakterial dapat dilakukan menggunakan antibiotik, akan tetapi
penggunaan ini telah dibatasi dan adanya larangan ekspor udang yang
teridentifikasi mengandung antibiotik tertentu. Hal ini disebabkan, penggunaan
antibiotik yang terus menerus di lingkungan akuakultur dapat menyebabkan
bahaya pada organisme akuatik dan manusia sebagai konsumen. Penggunaan
bakteriofage (fage) dapat menjadi solusi alternatif ramah lingkungan untuk
menggantikan antibiotik. Fage adalah pembunuh bakteri spesifik dan efektif untuk
mengendalikan infeksi bakteri. Penelitian ini bertujuan melakukan isolasi dan
evaluasi potensi fage untuk pengendalian infeksi V. parahaemolyticus pada udang
vaname.
Fage diisolasi dari sampel air, sedimen dan udang dari tambak di berbagai
daerah di Indonesia, yaitu provinsi Lampung, Banten, Jawa Barat, Jawa Tengah,
DI Yogyakarta, Jawa Timur dan Nusa Tenggara Barat. Selanjutnya sampel
sedimen dihomogenkan dengan phosphate buffer saline (PBS) 1:1 (b/v) dan usus
udang digerus dengan menambahkan PBS 1:1 (b/v). Tiap cairan sampel
disentrifugasi, supernatan yang diperoleh ditambahkan V. parahaemolyticus dan
diplating menggunakan metode double layer agar, plak yang terbentuk
diindikasikan sebagai fage. Penelitian ini menggunakan rancangan acak lengkap
dengan dua tahap yaitu uji in vitro dan in vivo. Uji in vitro terdiri dari 6 perlakuan
dengan 3 ulangan, yaitu saline magnesium (SM)-buffer tanpa V. parahaemolyticus
(KN), SM-buffer dan V. parahaemolyticus 107 CFU/mL (KP), antibiotik
klortetrasiklina dan V. parahaemolyticus 107 CFU/mL (KA), fage 107 PFU/mL
dan V. parahaemolyticus 107 CFU/mL (FB7), dan fage 108 PFU/mL dan V.
parahaemolyticus 107 CFU/mL (FB8), fage 109 PFU/mL dan V. parahaemolyticus
107 CFU/mL (FB9). Uji in vivo dilakukan dengan uji tantang V. parahaemolyticus
(105 CFU/mL) pada udang melalui perendaman dan mengaplikasikan densitas
fage melalui pakan, dengan cara pakan disemprot campuran suspensi fage dan
putih telur, dikering anginkan dan disimpan pada suhu 4 oC sampai digunakan. Uji
ini menggunakan 7 perlakuan dengan 3 ulangan, dengan 6 perlakuan sama dengan
uji in vitro dan ditambahkan 1 perlakuan yaitu pakan + fage 109 PFU/mL (KF).
Uji in vitro dilakukan dengan masing-masing perlakuan dimasukkan ke
dalam microplate dan diamati menggunakan spektrofometer. Uji in vivo pada
akuarium dilakukan uji tantang dengan V. parahaemolyticus pada hari ke-0
(sebelum perlakuan) dan satu jam kemudian diberi pakan uji sesuai perlakuan
dengan penambahan fage dan antibiotik sebanyak 2 kali sehari secara at satiation,
kemudian diamati setiap hari selama 7 hari. Parameter yang diukur yaitu
kelangsungan hidup, uji hambat bakteri dan parameter sistem imun meliputi total
hemocyte count (THC), aktivitas fagositosis (AF), aktivitas respiratory burst
(RB), aktivitas phenoloxidase (PO), gejala klinis dan histopatologi.
iii
Penelitian ini berhasil mengisolasi fage yang bersumber dari air tambak
udang di daerah Jawa Timur yang ditandai terbentuknya plak pada media double
layer agar, dengan ciri morfologisnya berbentuk titik-titik dan bulat besar, tepian
rata dan bergelombang serta memiliki warna plak yang jernih. Plak fage berhasil
diperbanyak dengan densitas fage rata-rata 3,5 x 109 PFU/mL. Hasil kisaran inang
fage menggunakan 6 bakteri (3 jenis bakteri dan 3 strain V. parahaemolyticus yang
berbeda) menunjukkan hanya bakteri V. parahaemolyticus asal Situbondo yang
dapat lisis oleh fage hasil isolasi, sedangkan bakteri lainnya tidak. Pada uji in vitro
hasil daya hambat bakteri menunjukkan perlakuan densitas fage (FB7, FB8 dan
FB9) dan KA berbeda nyata (P<0,05) dibandingkan dengan KN dan KP. Semua
perlakuan fage mampu mengurangi kepadatan V. parahaemolyticus. Hasil terbaik
pada perlakuan fage adalah FB9 yang mampu menghambat pertumbuhan V.
parahaemolyticus sebesar 48,4% dibandingkan dengan KP. Hal ini menunjukkan
bahwa fage mampu melisiskan bakteri inang (V. parahaemolyticus).
Hasil uji in vivo menunjukkan kelangsungan hidup udang vaname pada
perlakuan densitas fage yang berbeda (FB7, FB8 dan FB9) dan KA meningkat dan
berbeda nyata (P<0,05) dibandingkan dengan KP, kelangsungan hidup pada
perlakuan FB9 memberikan hasil tertinggi yaitu sebesar 76,67% dibandingkan
dengan perlakuan KP sebesar 56,56%. Perlakuan FB9 dan KA mampu
meningkatkan kelangsungan hidup udang vaname berturut-turut sebesar 29,85%
dan 37,14% dibandingkan dengan perlakuan KP. Hasil daya hambat bakteri
menunjukkan densitas fage yang berbeda (FB7, FB8 dan FB9) mampu
mengurangi V. parahaemolyticus pada hepatopankreas dan usus udang vaname
dan berbeda nyata dibandingkan dengan perlakuan KP (P<0,05). Setelah diamati
selama 7 hari setelah infeksi pada perlakuan densitas fage yang berbeda, total
vibrio count mengalami penurunan yang terus menerus mulai dari hari ke-1 hingga
ke-5, tidak ada pertumbuhan koloni hijau pada hari ke-6 hingga ke-7.
Hasil THC dan AF pada perlakuan densitas fage yang berbeda (FB7, FB8
dan FB9) dan KA menunjukkan peningkatan nilai THC dan AF setelah infeksi,
sedangkan pada perlakuan KP terjadi penurunan jumlah hemosit dan persentase
AF secara drastis. Pola RB dan PO mengalami peningkatan setiap harinya setelah
infeksi pada perlakuan densitas fage yang berbeda dibandingkan dengan
perlakuan KP yang mengalami penurunan setiap harinya dan berbeda nyata
(P<0,05). Hal ini membuktikan bahwa perlakuan fage (FB7, FB8 dan FB9) dan
KA mampu meningkatkan pertahanan tubuh udang dibandingkan dengan
perlakuan KP. Histopatologi menunjukkan perlakuan KP mengalami kerusakan
parah ditandai dengan banyaknya nekrosis pada hepatopankreas dibandingkan
perlakuan densitas fage yang mengalami kerusakan relatif ringan. Kesimpulan
penelitian ini bahwa fage berhasil diisolasi dari sampel air tambak daerah Jawa
Timur dan berpotensi untuk mengendalikan infeksi V. parahaemolyticus karena
mampu meningkatkan respons imun dan resistansi pada udang vaname dengan
hasil terbaik pada densitas fage 109 PFU/mL. Saran penelitian ini perlu dilakukan
penelitian lebih lanjut menggunakan cocktail fage untuk mendapatkan hasil yang
optimal dikarenakan menggunakan fage tunggal hasil yang didapatkan belum
sebaik penggunaan antibiotik. Vibrio parahaemolyticus which produces toxin PirA and PirB is the
causative agent of acute hepatopancreatic necrosis disease which causes mass
death of up to 100% of shrimp farmed. Control of bacterial diseases can be done
using antibiotics, but this use has been restricted and there is a ban on the export
of shrimp identified as containing certain antibiotics. This is because, the
continuous use of antibiotics in the aquaculture environment can cause harm to
aquatic organisms and humans as consumers. The use of bacteriophages (phages)
can be an environmentally friendly alternative solution to replace antibiotics.
Phages are specific and effective bacterial killers for controlling bacterial
infections. This study aims to isolate and evaluate the potential of phages for the
control of V. parahaemolyticus infection in whiteleg shrimp.
Phages were isolated from water, sediment, and shrimp samples from
ponds in various regions in Indonesia, namely the provinces of Lampung, Banten,
West Java, Central Java, DI Yogyakarta, East Java, and West Nusa Tenggara.
Furthermore, the sediment sample was homogenized with phosphate buffer saline
(PBS) 1:1 (b/v), and shrimp intestines were crushed by adding PBS 1:1 (b/v).
Each sample liquid was centrifuged, and the supernatant obtained was added V.
parahaemolyticus and plated using the double layer method so that the plaque
formed is indicated as a phage. This study used a complete randomized design
with two stages: in vitro and in vivo tests. The in vitro test consisted of 6 treatments
with 3 repeats, namely saline magnesium (SM)-buffer without V.
parahaemolyticus (KN), SM-buffer and V. parahaemolyticus 107 CFU/mL (KP),
chlortetracycline antibiotics and V. parahaemolyticus 107 CFU/mL (KA), phages
107 PFU/mL and V. parahaemolyticus 107 CFU/mL (FB7), and phages 108
PFU/mL and V. parahaemolyticus 107 CFU/mL (FB8), phages 109 PFU/mL and
V. parahaemolyticus 107 CFU/mL (FB9). In vivo tests were carried out by
challenge test V. parahaemolyticus (105 CFU/mL) on shrimp by soaking and
applying phage density through feed by spraying feed a mixture of phage
suspension and egg white, dried aerated and stored at 4 oC until used. This test
uses 7 treatments with 3 repeats, with 6 treatments equal to the in vitro test and
added 1 treatment, namely feed + phage 109 PFU/mL (KF).
In vitro tests are performed with each treatment inserted into a microplate
and observed using a spectrophotometer. In vivo tests were conducted with V.
parahaemolyticus on day 0 (before treatment) and one hour later fed according to
treatment with the addition of phages and antibiotics 2 times a day at satiation,
then observed every day for 7 days. The parameters measured are survival rate,
bacterial inhibition test and immune system parameters including total hemocyte
count (THC), phagocytosis activity (AF), respiratory burst activity (RB),
phenoloxidase activity (PO), clinical symptoms and histopathology.
This study succeeded in isolating phages sourced from shrimp pond water
in the East Java area which is characterized by plaque formation on double layer
agar media, with morphological characteristics in the form of dots and large
v
rounds, flat and wavy edges and has a clear plaque color. Phage plaques were
successfully propagated with an average phage density of 3.5 x 109 PFU/mL. The
results of the phage host range using 6 bacteria (3 types of bacteria and 3 different
strains of V. parahaemolyticus) showed that only V. parahaemolyticus bacteria
from Situbondo could be lysed by isolated phages, while other bacteria could not.
In vitro tests, the results of bacterial inhibition showed that phage density (FB7,
FB8 and FB9) and KA treatments were significantly different (P<0.05) compared
to KN and KP. All phage treatments were able to reduce the density of V.
parahaemolyticus. The best result in phage treatment was FB9 which was able to
inhibit the growth of V. parahaemolyticus by 48.4% compared to KP. This
suggests that phages are capable of lysing host bacteria (V. parahaemolyticus).
The results of in vivo tests showed that the survival rate of whiteleg shrimp
in different phage density treatments (FB7, FB8 and FB9) and KA increased and
differed markedly (P<0.05) compared to KP, survival rate in FB9 treatment gave
the highest result of 76.67% compared to KP treatment of 56.56%. FB9 and KA
treatment was able to increase the survival rate of whiteleg shrimp by 29.85% and
37.14% respectively compared to KP treatment. The results of bacterial inhibition
showed different phage densities (FB7, FB8 and FB9) were able to reduce V.
parahaemolyticus in hepatopancreas and intestines of whiteleg shrimp and were
significantly different from KP treatment (P<0.05). After being observed for 7
days post-infection at different phage density treatments, the total vibrio count
decreased continuously from days 1 to 5, with no growth of green colonies on days
6 to 7.
The results of THC and AF in different phage density treatments (FB7,
FB8 and FB9) and KA showed an increase in THC and AF values after infection,
while the KP treatment decreased the number of hemocytes and the percentage of
AF drastically. RB and PO patterns increased every day after infection in different
phage density treatments compared to KP treatments which decreased daily and
were significantly different (P<0.05). This proves that phage treatment (FB7, FB8
and FB9) and KA can increase shrimp body defenses compared to KP treatment.
Histopathology shows that KP treatment has severe damage characterized by a lot
of necrosis in the hepatopancreas compared to phage density treatment which has
relatively mild damage. This study concludes that the phage was successfully
isolated from pond water samples in East Java and has the potential to control V.
parahaemolyticus infection because it can increase immune response and
resistance in whiteleg shrimp with the best results at a phage density of 109 PFU /
mL. The suggestion of this study needs further research using cocktail phages to
get optimal results because using a single phage the results obtained are not as
good as the use of antibiotics.
Collections
- MT - Fisheries [3016]