Kloning dan ekspresi daerah determinan "a" gen S Virus hepatitis B pada khamir saccharomyces cerevisiae YRD15

Abstract

Hepatitis B merupakan penyakit infeksi hati yang disebabkan oleh virus hepatitis B (VHB). Virus ini telah menginfeksi sekitar 2 milyar orang di seluruh dunia. Prevalensi VHB di Indonesia berkisar antara 3- 20 persen. Upaya terbaik untuk menghambat transmisi VHB menurut badan kesehatan dunia WHO adalah melalui vaksinasi. Vaksin hasil rekayasa genetik lebih dipilih karena memiliki beberapa keunggulan dibanding vaksin yang berasal dari serum darah. Penelitian ini bertujuan mengklon dan mengekspresikan daerah determinan "a" gen S VHB pada khamir Saccharomyces cerevisiae YRD15. Hasil ekspresi merupakan bahan dasar pembuatan vaksin hepatitis B rekombinan yang dapat digunakan untuk mencegah penyebaran virus hepatitis B khususnya di Indonesia. Pada penelitian ini, daerah determinan "a" diamplifikasi dan kemudian diligasi ke dalam vektor PGEM-T. Produk ligasi selanjutnya ditransformasi ke dalam sel Escherichia coli DH5a. Setelah koloni bakteri yang mengandung plasmid rekombinan diseleksi, plasmid rekombinan ini (pGEM-T/determinan "a" -6xHis tag) diisolasi dari sel. Sekuen basa DNA target dikonfirmasi dengan analisis sekuensing nukleotida. Klon rekombinan yang mengandung DNA sisipan yang diinginkan selanjutnya diputus dengan enzim restriksi EcoRI and BamHI. Fragmen DNA yang diinginkan kemudian diligasi ke dalam vektor ekspresi khamir pYES2/CT dan plasmid rekombinannya ditransformasi ke dalam khamir S. cerevisiae YRD15. Sel transforman yang membawa plasmid rekombinan diseleksi di dalam media minimum. Untuk mengkonfirmasi keberadaan DNA yang diklon, plasmid diisolasi dari sel khamir. Plasmid tersebut lalu ditransformasi ke dalam sel E. coli DH5 dan sel transforman kemudian dikultur ke dalam media LBA. Klon yang diinginkan diseleksi dengan memanfaatkan gen resisten antibiotik ampisilin dan teknik PCR screening. Koloni yang terseleksi dipecah untuk mendapatkan plasmid rekombinan dari sel. Sekuen DNA sisipan selanjutnya dikonfirmasi lagi menggunakan analisis sekuensing. Hasil sekuensing dijadikan sebagai tanda untuk dilakukannya proses ekspresi gen. Pada tahap ekspresi, khamir yang mengandung plasmid rekombinan dikultur pada media selektif mengandung glukosa 2% dan ekspresi diinduksi dengan penambahan galaktosa dalam berbagai konsentrasi (2%, 2,2%, 2,5%, 2,83%, dan 3%). Ekspresi dilakukan pada suhu 28°C dan 32°C. Setelah induksi galaktosa dalam interval waktu berbeda, sel dipanen dan protein produk ekspresinya diisolasi. Selanjutnya teknik SDS-PAGE dan analisis western blot dilakukan untuk mendeteksi keberadaan protein yang diinginkan. Produk protein yang diduga selanjutnya dimurnikan dengan kromatografi afinitas menggunakan Ni IDA agarose. Hasil penelitian menunjukkan bahwa melalui teknik PCR, daerah determinan "a" gen S VHB dengan panjang 447 pb yang mengandung situs restriksi BamHI dan EcoRI berhasil didapatkan. Fragmen DNA yang diinginkan juga berhasil diklon ke dalam vektor ekspresi pYES2/CT dan plasmid rekombinannya berhasil diintroduksi ke dalam sel inang E. coli DH5a dan S. cerevisiae YRD15. Namun, produk ekspresi belum berhasil didapatkan di bawah kondisi ekspresi yang dilakukan.