Berbagai tipe konstruksi gen cp PStV yang dapat memproteksi tanaman nicotiana benthamiana transgenik terhadap infeksi PStV dan transformasi gen cp PStV pada kacang tanah

Abstract

Disertasi ini dirnulai dari BAB I. Pendahuluan Umum dan BAB II. Tinjauan Pustaka. Selanjutnya ditulis hasil-hasil serangkaian percobaan yang mengarah kepada pembentukan tanaman Nicotiana henthamiana dan kacang tanah tahan PStV. terutama dengan memanfaatkan teknik transformasi gen dengan bantuan Agrobacterium tumefaciens. Gen ketahanan terhadap PStV dalam penelitian ini diambil dari gen coat protein PStV itu sendiri, terdiri atas empat tipe konstruksi yaitu pBINRCPL pBINRCP2. pBINRCP3, dan pBINRCP4. Untuk mengetahui dengan cepat efektivitas keempat gen ini dalam memberikan sifat ketahanan tanaman terhadap PStV digunakan tanaman model. yaitu N benthamiana. Setelah diketahui konstruksi gen yang paling efekti1~ konstruksi ini akan diintroduksikan ke tanaman kacang tanah. Dengan demikian dalarn penelitian ini digunakan dua tanaman yaitu N henthamiana sebagai tanaman model dan kacang tanah (Arachis hypogaea L) sebagai tanaman utarna yang diinginkan memperoleh sifat ketahanan terhadap PStV. Untuk keberhasilan regenerasi tanaman transgenik diperlukan adanya empat syarat yaitu: (i) tersedianya gen yang akan diintroduksikan; (ii) metode introduksi gen tersebut ke tanaman target: (iii) metode regenerasi tanaman yang efektif secara in virro: dan (iv) kemampuan untuk mengekspresikan gen yang telah terintegrasi dalam genom tanaman. Untuk memperoleh tanarnan transgenik N. benthamianu juga diperlukan keempat syarat di atas. Syarat pertama yaitu tersedianya gen yang akan diintroduksikan. Gen-gen yang digunakan dalam penelitian ini adalah gen cp PStV dan dua gen marker [gen /3-glucoronidase (gus) dan gen green fluorescent protein (g/p)]. Gen cp dan gen gus sudah dikonstruksi oleh peneliti lain sedangkan gen gfp dikonstruksi dalam penelitian ini (dilakukan di QABC. Queensland. Australia). Konstruksi dan kloning gen gfjJ dilakukan untuk memperoleh gen marker yang Iebih baik dibandingkan gen marker lain (seperti gen gus dan gen luc). Dengan tersedianya konstruksi gen marker ini. pengembangan metode transforrnasi tanaman dapat dilakukan tanpa menggunakan esei yang sifatnya destruktif jadi jaringan/eksplan tidak rnati seperti yang terjadi pada esei GUS. Dari penelitian yang ditulis pada BAB III ini dihasilkan dua plasmid yaitu pSAQl (singkatan dari Sholeh Avivi QABC) dan pSAQ2. Gen gfp dalam plasmid basil rekonstruksi dapat diekpresikan dengan baik pada tanaman tembakau W38. Plasmid hasil penelitian ini digunakan untuk membandingkan efektifitas transfer gen pada BAB VI. I

Peanut stripe virus (PStV) is one of the most important virus diseases in peanut. It causes severe reduction in yield and seed quality of peanut. Hence it is a significant constraint to peanut production in Indonesia. In this study, we aim to generate genetically-modified commercial peanut cultivars that are resistant to PStV infection by expressing viral coat protein sequence in transgenic plants. To achieve this objective, several experiments have been conducted, such as: (1) Construction of non-destructive selectable marker gene, green fluorescens protein (g/p), for expression in plants; (2) Evaluation of various types of PStV cp transgene(s) to protect transgenic Nicotiana benthamiana from PStV; (3) The development of procedures for obtaining efficient somatic embryos in peanut; (4) Agrobacterium-mediated transformation of peanut somatic embryos; and ( 5) Regeneration of transgenic peanut carrying PStV cp transgene(s). The PStV cp transgene was isolated from coat protein gene sequence of PStV isolate from Malang (Indonesia), and was constructed in four different types: pBINRCP 1 (full length translatable), pBINRCP2 (full length translatable, modified DAG motif), pBINRCP3 (full length untranslatable), and pBINRCP4 (terminally truncated). From these current studies, two binary plasmids carrying gfp expression cassette were obtained: PSAQl and PSAQ2 (abbreviated from Sholeh Avivi-QABC). These binary plasmids could be successfully transformed and expressed in tobacco cv. W38. For N benthamiana regeneration of transgenic plants was obtained by using leaf segments as explants, 10 minutes inoculation with Agrobacterium, 24 hour co-cultivation, and using bacterial concentration at OD600=0.5. Using this method, 71 transgenic lines of N benthamiana have been produced and when mechanically inoculated under plastic house conditions, 34 of those showed various degree of resistance to PStV. The best construct showing highest level of resistance to PStV was pBINRCP3. Furthermore, several PStV resistance N benthamiana lines carrying pBINRCP4 have also been challenged with potato virus Y (PVY). The result indicated the potential of using pBINRCP4 for broad spectrum resistance to diseases caused by Potyviruses. Research in peanut was started with optimization of somatic embryo regeneration. The best regeneration method was obtained using protocols developed by Edy (1998), using embryo axes from mature seed devoid of radicle and leaflet as explants and culturing them on MS16 medium [ MS salts a'ld vitamines (Murashige and Skoog, 1962), sucrose [2%], agar [0.8%], and picloram [16 μM]]. Effective Agrobacterium-mediated transformation method was performed by using peanut embryogenic calli at 49 day after induction, 15 minutes inoculation with Agrobacterium, 24 hour co-cultivation, and with bacterial concentration at OD6oo=0.5. Using this method, transformation efficiency at 20% was observed. Until the end of the study, putative transformed peanut embryos carrying PStV pBINRCPl, pBINRCP2, pBINRCP3, and pBINRCP4 were still being regenerated on selective medium.