Biochemical and Transcriptomic Analyses in Phalaenopsis Response to Soft-Rot Disease Pathogen (Dickeya dadantii)

Abstract

Phalaenopsis orchid is one of the orchid genera with high ornamental and economic value. Soft-rot disease (SRD) is a devastating disease in Phalaenopsis orchid caused by the necrotrophic pathogens, Dickeya dadantii. Evaluations of several Phalaenopsis species for their response to D. dadantii infection reveal that P. amboinensis is the most resistant, while P. amabilis is a very susceptible species. Resistant species information related to biochemical and molecular response under pathogen infection is essential in providing resistant parents to conduct conventional and molecular breeding programs of Phalaenopsis. Resistant species can be used as the parent in cross-breeding, while the biochemical and molecular mechanism of plant resistance can be used to develop biochemical and molecular markers for selecting resistant progenies. The main purpose of the research is to identify the intraspecies variation response of P. amboinensis and P. amabilis to SRD pathogens and analyze the possible resistance mechanism through a biochemical and transcriptomic approach. The research is provided on three topics. The first topic aims to evaluate intraspecies resistant variation in the P. amboinensis and P. amabilis wild populations and identify the plants that show resistance or susceptible responses to D. dadantii consistently to be used as breeding materials and resistant mechanism study in further experiments. The second topic was aimed to study the possible role of Phenylalanine ammonia-lyase (PAL), Peroxidase (POD), salicylic acid (SA) and jasmonic acid (JA) in the susceptible or resistance response of P. amboinensis and P. amboinensis to D. dadantii infection and its potential for biochemical markers for resistance to SRD. In the third topic, transcriptomic analyses based on the RNA sequencing approach were performed in P. amboinensis as a prospective resistant parent to predict the molecular plant response to D. dadantii infection and the potential genes and molecular mechanism involved in resistant species. The research results show the intraspecies variation of P. amboinensis and P. amabilis wild populations in their response to D. dadantii infection. The responses of 47 P. amboinensis and 29 P. amabilis individuals were tested against D. dadantii using the detached leaf inoculation method. Soft-rot symptom diameter was measured at 6 to 42 hours post-inoculation (HPI) for disease assessment, including disease symptom diameter, disease severity, and resistance level to D. dadantii. Of 47 plants of P. amboinensis, 2.13% are very susceptible, 2.12% are susceptible, 4.25% are moderate resistant, and 91.49% are resistant, while in P. amabilis, 20.69% are very susceptible, 3.45% are susceptible, 13.78% are moderate susceptible, and 62.08% are resistant. SRD-resistance trait in P. amboinensis is more stable compared to the P. amabilis. The selected resistant plants of P. amboinensis and very susceptible plants of P. amabilis were used for the second and third topics of the dissertation. The second topic of the research was predicting the biochemical defense (defense-related enzymes, PAL and POD, and signal transduction hormones (SA and JA) that may be involved in Phalaenopsis resistance mechanisms to SRD pathogen. The endogenous PAL, POD, SA and JA were measured under mock and D. dadantii inoculation on P. amboinensis and P. amabilis. The results showed that PAL and POD activities were higher in P. amabilis (susceptible plants) than in P. amboinensis (resistant plants); conversely, P. amboinensis has a higher SA content than P. amabilis at 12 HPI, suggesting their involvement in resistance response. The endogenous SA and JA content were higher in P. amboinensis than in P. amabilis at 12 and 24 HPI. Besides, exogenous JA treatment delayed soft-rot disease progress in P. amabilis while SA increased its susceptibility to D. dadantii. These results suggested that PAL, POD, and SA may be involved in the susceptibility response of P. amabilis while JA is potentially involved in Phalaenopsis resistance, prospective to increase the resistance level of P. amabilis at 0.18 mM or higher. In the third topic of this research, transcriptomic analyses based on the RNA sequencing approach were performed in P. amboinensis to reveal the species-resistant response mechanisms to D. dadantii. The RNA sequencing using Illumina NextSeq 500 with a paired-end of 150 bp was performed on isolated RNA from 3 mocks and 3 D. dadantii inoculate leaves samples of P. amboinensis. It generated 38.45 and 39.00 GB raw reads from inoculated leaves and mock samples, respectively. Bioinformatic analyses were carried out to obtain annotated transcriptome reference and differentially expressed genes (DEGs). The resulting contigs from the Trinity assembly (52,217 contigs) were blasted to the public database. As many as 77%, 49%, 54%, and 2% have been annotated to NR-NCBI, Uniprot, GO, and KEGG databases, respectively. DEG analyses were performed between mock and D. dadantii inoculated P. amboinensis treatments. ANOVA analyses showed 32,253 DEGs from the two treatments with a false discovery rate (FDR) <1%. As many as 20 filtered up-regulated genes were used to predict the resistant response mechanism of P. amboinensis to D. dadantii infection. The overall results from the first, second and third topics of the research suggested that P. amboinensis is a prospective parent for breeding of resistant Phalaenopsis to D. dadantii. The resistant mechanism of P. amboinensis may be related to the high content of endogenous JA. Exogenous JA treatment could delay the disease progress in P. amabilis, and transcriptomic analyses suggested the several up- and down-regulated genes that may have a role in P. amboinensis resistant to D. dadantii.

Anggrek Phalaenopsis merupakan salah satu genus anggrek yang memiliki nilai hias dan nilai ekonomi yang tinggi. Penyakit busuk lunak (soft-rot disease/SRD) merupakan penyakit penting pada anggrek Phalaenopsis yang disebabkan oleh patogen nekrotropik, Dickeya dadantii. Evaluasi ketahanan pada beberapa spesies Phalaenopsis terhadap infeksi D. dadantii menunjukan bahwa P. amboinensis adalah yang paling tahan, sedangkan P. amabilis adalah spesies yang sangat rentan. Informasi spesies tahan terkait dengan respon biokimia dan molekuler setelah infeksi patogen penting dalam menyediakan tetua tahan untuk melakukan program pemuliaan konvensional dan molekuler. Spesies tahan dapat digunakan sebagai tetua dalam persilang, sedangkan mekanisme biokimia dan molekuler ketahanan tanaman dapat digunakan untuk mengembangkan penanda biokimia dan molekuler untuk menyeleksi progeni yang tahan. Tujuan utama dari penelitian ini adalah untuk mengidentifikasi respon variasi ketahanan intraspesies P. amboinensis dan P. amabilis terhadap patogen SRD dan menganalisis kemungkinan mekanisme ketahanan melalui pendekatan biokimia dan transkriptomik. Penelitian ini terbagi dalam tiga topik. Topik pertama bertujuan untuk mengevaluasi variasi ketahanan intraspesies pada populasi liar P. amboinensis dan P. amabilis serta mengidentifikasi tanaman yang menunjukkan tahan atau respon rentan terhadap D. dadantii secara konsisten untuk digunakan sebagai bahan pemuliaan dan studi mekanisme ketahanan pada percobaan selanjutnya. Topik kedua bertujuan untuk mempelajari kemungkinan peran PAL dan POD serta asam salisilat (SA) dan asam jasmonat (JA) dalam respon rentan atau tahan P. amboinensis dan P. amabilis terhadap infeksi D. dadantii dan potensinya sebagai penanda biokimia. Pada topik ketiga, analisis transkriptomik berdasarkan pendekatan perunutan RNA dilakukan pada P. amboinensis sebagai tetua tahan untuk memprediksi respon molekuler tanaman terhadap infeksi D. dadantii dan gen potensial serta mekanisme molekuler yang terlibat dalam spesies tahan. Hasil penelitian menunjukkan adanya variasi ketahanan intraspesies pada populasi liar P. amboinensis dan P. amabilis dalam responnya terhadap infeksi D. dadantii. Respon 47 individu P. amboinensis dan 29 individu P. amabilis diuji terhadap D. dadantii dengan metode inokulasi detached leaf. Diameter gejala busuk lunak diukur pada 6 sampai 42 jam pasca inokulasi (HPI) untuk menghitung penilaian penyakit termasuk diameter gejala penyakit, keparahan penyakit, dan tingkat ketahanan terhadap D. dadantii. Dari 47 tanaman P. amboinensis, 2,13% sangat rentan, 2,12% rentan, 4,25% agak tahan, dan 91,49% tahan, sedangkan pada P. amabilis, 20,69% sangat rentan, 3,45% rentan, 13,78% agak rentan, dan 62,08% tahan. Sifat ketahanan pada P. amboinensis lebih stabil dibandingkan dengan P. amabilis. Tanaman terpilih P. amboinensis tahan dan tanaman P. amabilis sangat rentan dipilih untuk penelitian pada topik kedua dan ketiga dari disertasi ini. Topik penelitian kedua adalah memprediksi mekanisme ketahanan biokimia (enzim yang berhubungan dengan pertahanan yaitu Phenylalanine-ammonia lyase; PAL dan peroksidase; POD dan hormon transduksi sinyal asam salisilat; SA dan asam jasmonat; JA) yang mungkin terlibat dalam mekanisme ketahanan Phalaenopsis terhadap patogen SRD. PAL, POD, SA dan JA endogen diukur dengan inokulasi patogen dan inokulasi tiruan pada P. amboinensis dan P. amabilis. Hasil penelitian menunjukkan bahwa aktivitas PAL dan POD lebih tinggi pada P. amabilis (rentan) dibandingkan P. amboinensis (tahan), sebaliknya P. amboinensis memiliki kandungan SA lebih tinggi daripada P. amabilis pada 12 HPI, diprediksi terlibat dalam respon ketahanan terhadap infeksi D. dadantii. Kandungan SA dan JA endogen lebih tinggi pada P. amboinensis daripada P. amabilis pada 12 dan 24 HPI. Selain itu, perlakuan JA secara eksogen mampu memperlambat perkembangan penyakit busuk lunak pada P. amabilis namun SA meningkatkan kerentanan terhadap D. dadantii. Hasil ini menunjukkan bahwa PAL, POD, dan SA mungkin terlibat dalam respon kerentanan P. amabilis sedangkan JA berpotensi terlibat dalam ketahanan Phalaenopsis, prospektif untuk meningkatkan tingkat ketahanan P. amabilis pada konsentrasi 25 mM atau lebih tinggi. Pada topik ketiga, analisis transkriptomik berdasarkan pendekatan perunutan RNA dilakukan pada P. amboinensis untuk mengungkap mekanisme respon spesies tahan terhadap infeksi D. dadantii. Perunutan RNA dilakukan menggunakan Illumina NextSeq 500 dengan pair-end 150 bp dengan sampel berupa RNA dari 3 tanaman P. amboinensis dengan perlakuan mock dan 3 tanaman lain dengan perlakuan diinokulasi D. dadantii. perunutan RNA yang dilakukan berhasil menghasilkan raw reads sebanyak 38.45 (inokulasi D. dadantii) dan 39.00 GB (mock). Analisis bioinformatika dilakukan untuk mendapatkan referensi transkriptom teranotasi dan gen yang diekspresikan secara berbeda (DEG). Contig yang dihasilkan dari Trinity assembly (52.217 contigs) di-blast ke database publik. Sebanyak 77%, 49%, 54%, 2% telah dianotasi ke database NR-NCBI, Uniprot, GO, dan KEGG secara berurutan. Analisis Anova menunjukkan 32.253 DEG dari kedua perlakuan dengan false discovery rate (FDR) <1%. Sebanyak 20 gen up-regulated terpilih digunakan untuk memprediksi mekanisme respon tahan P. amboinensis terhadap infeksi D. dadantii. Hasil keseluruhan dari topik penelitian pertama, kedua dan ketiga menunjukkan bahwa P. amboinensis merupakan tetua potensial untuk perakitan Phalaenopsis yang tahan terhadap D. dadantii. Mekanisme ketahanan P. amboinensis diduga berhubungan dengan tingginya kandungan JA endogen. perlakuan JA eksogen dapat memperlambat perkembangan penyakit pada P. amboinensis, dan analisis transkriptomik menunjukkan beberapa gen dengan regulasi up- dan down-regulated yang mungkin memiliki peran dalam ketahanan P. amboinensis terhadap D. dadantii.