Konstruksi Kaset CRISPR/Cas9 untuk Pengeditan Gen OsARF2 dan Perakitan Tanaman Padi Transgenik yang Mengandung CRISPR/Cas9-OsARF2

Abstract

Padi merupakan tanaman pangan utama bagi penduduk Indonesia. Kebutuhannya selalui diiringi dengan perkembangan populasi penduduk, untuk mengimbanginya diperlukan upaya peningkatan produktivitas padi. Salah satu upaya yang bisa dilakukan dengan melakukan pemupukan unsur Kalium. Akan tetapi, kurang efisiennya kemampuan tanaman padi dalam menyerap K menjadi kendala, Sehinga diperlukan perbaikan genetika tanaman padi yang efisien dalam menyerap K, yaitu dengan merekayasa gen yang berperan dalam penyerapan dan translokasi K. Penyerapan K di akar dan translokasi K sangat bergantung pada sejumlah besar kanal dan transporter K. HAK5 merupakan salah satu transporter K dari famili HAK/KUP/KT (High Affinity K+ transporter/K+ Uptake Permease/ K+ Transporter) ekspresinya HAK5 diregulasi oleh faktor transkripsi ARF2 (Auxin Response Factor 2) yang bertindak sebagai represor. Faktor transkripsi ARF2 pada yang berperan dalam meregulasi ekspresi HAK5 dapat dijadikan landasan dalam upaya meningkatkan efisiensi penyerapan K pada tanaman padi. Strategi peningkatan efisiensi penyerapan K yang dapat ditempuh adalah dengan merekayasa faktor transkripsi ARF2 dengan mengedit gen tersebut menggunakan teknik CRISPR/Cas9 yang menyebabkan ARF2 tidak berfungsi. Penelitian ini bertujuan untuk membuat konstruk CRISPR/Cas9 yang membawa RNA penuntun (gRNA) OsARF2, dan perakitan tanaman padi varietas Nipponbare transgenik yang mengandung CRISPR/Cas9-gRNAOsARF2 dalam rangka mendapatkan tanaman padi mutan pada gen OsARF2 yang efisien dalam pemanfaatan K Konstruksi kaset CRISPR/Cas9 untuk pengeditan gen OsARF2 terdiri atas tiga tahap. (1) perancangan gRNA, (2) Penempelan oligonukleotida, dan (3) ligasi gRNA dengan pDIRECT_21A. Konstruk selanjutnya diintroduksikan ke E.coli DH5α dan dikonfirmasi. Konstruk yang terkonfirmasi diintroduksikan ke A. tumefaciens LBA4404 untuk diintroduksikan ke tanaman padi Nipponbare. Padi transgenik putatif yang dihasilkan dianalisis keberadaan transgen Cas9 dan mutasi pada gen OsARF2. gRNA telah berhasil didesain dengan dua situs yang berbeda pada gen OsARF2. Kedua gRNA, gRNAOsARF2-A dan gRNAOsARF2-B, telah diligasi dengan plasmid pDIRECT_21A sehingga menghasilkan konstruk CRISPR/Cas9-gRNAOsARF2. Konstruk CRISPR/Cas9-gRNAOsARF2-A dan CRISPR/Cas9-gRNAOsARF2-B telah berhasil diintroduksikan secara terpisah ke padi Nipponbare dengan transformasi yang dimediasi Agrobacterium menghasilkan padi transgenik putatif. Analisis integrasi gen Cas9 menunjukkan bahwa 11 dari 28 galur padi transgenik putatif N-ARF2-A merupakan galur transgenik yang mengandung transgen Cas9. Hasil analisis sekuensing dari dua galur tanaman terpilih mengindikasikan gen OsARF2 belum termutasi.

Rice is the main food crop in Indonesia. Their needs are always accompanied by population growth. As the population growth the rice productivity needs to increase. One of the attempts to increase rice productivity is potassium fertilizing. But, the low ability of rice to uptake the K+ make the fertilizing inefficient. Genetic modification of potassium adsorption and translocation genes can be applied as an approach to improve plant ability to uptake K+. K+ uptake in root and K+ translocation depend on many K+ channel and transporter. HAK5 is one of the K+ transporters from HAK/KUP/KT (High Affinity K+ transporter/K+ Uptake Permease/ K+ Transporter) family in which the expression is down regulated by ARF2 (Auxin Response Factor 2) transcription factor. Based on these literature, mutation of ARF2 transcription factor can be applied to improve the ability of rice to uptake K+ by genome editing using CRISPR/Cas9. In this study, we aims to make CRISPR/Cas9 construct that carrying gRNA to knock out OsARF2 gene and to obtain Nipponbare transgenic containing CRISPR/Cas9-gRNAOsARF2. To construct CRISPR/Cas9 cassette there are three main steps. (1) gRNA design, (2) Oligonucleotide Annealing, (3) gRNA ligation with pDIRECT_21A. The contruct was introduced to E.coli DH5α and the confirmed construct was introduced to A. tumefaciens LBA4404 for Nipponbare transformation. The putatice transgenic plants was analyzed to confirm Cas9 transgene integration and the mutation in OsARF2 gene. Two different sites in OsARF2 gene were succesfully designed as gRNA of OsARF2. Both oligo duplex RNA guides, gRNAOsARF2-A and gRNAOsARF2-B, have been ligated with pDIRECT_21A plasmid. CRISPR/Cas9-gRNAOsARF2A and CRISPR/Cas9-gRNAOsARF2-B cassette were succesfuly introduced separately into Nipponbare rice genome via Agrobacterium-mediated transformation resulting putative transgenic lines. Anaysis of Cas9 gene integration by PCR showed that 11 of 28 N-ARF2-A putative transgenic lines containing Cas9 transgenic. The sequencing analysis results of the two selected lines indicated that the OsARF2 gene had not been mutated.