Konstruksi Vektor Ekspresi Gen KEX2-650 dan KEX2-620 Saccharomyces cerevisiae Pada Escherichia coli DH5α

Abstract

Kex2 merupakan protease spesifik (EC3.4.21.61) asal Saccharomyces cerevisiae yang memiliki fungsi mirip dengan furin pada mamalia dan memiliki homologi sekuen sebesar 47%. Kex2 secara alami merupakan protein intraselular sebagai protein transmembran, khususnya ditemukan pada membran retikulum endoplasmik dan trans golgi. Kex2 merupakan serin-protease yang mengikat ion Ca2+. Protein ini berperan dalam proses pemotongan protein prekursor pheromone mating-factor-α dan killer toxin M1 pada situs spesifik dimana dijumpai pasangan asam amino basa Lys-Arg atau Arg Arg saat protein tersebut dikirim keluar sel melalui jalur sekresi. Fungsi unik Kex2 dalam konversi prepro-protein menjadi protein matang, banyak dimanfaatkan seperti untuk pematangan proinsulin glargine menjadi glargine matang. Hal ini membuat pemilihan sistem ekspresi Kex2 secara ekstraselular pada pengoptimasian proses konversi akan sangat menguntungkan untuk optimasi proses konversi. Kex2 ekstraselular dapat diperoleh melalui rekayasa genetik, seperti delesi transmembran domain. Penelitian ini bertujuan mengkonstruksi varian vektor pD902-KEX2 dengan mengoptimalkan strategi modifikasi penghapusan daerah terminal-C termasuk domain transmembran dan Ser/Thr dari sekuen gen KEX2, serta introduksinya ke dalam Escherichia coli DH5α. Varian KEX2 yang dikonstruksi adalah KEX2-650 (tanpa domain transmembran) dan KEX2-620 (tanpa domain Ser/Thr dan domain transmembran). Plasmid rekombinan dikonstruksi melalui metode mutagenesis terarah dengan teknik PCR terhadap vektor pD902-KEX2-699 menggunakan pasangan primer FP-Kex2-699/RP-Kex2-650 dan FP-Kex2-699/RP-Kex2-620, masing-masing untuk KEX2-650 dan KEX2-620. Seluruh primer untuk mutagenesis terarah yang digunakan mengandung situs BamHI untuk religasi plasmid. Proses PCR pada mutagenesis terarah menghasilkan amplikon DNA dengan panjang sesuai yang diharapkan, yaitu sekitar 5551 pb dan 5461 pb masing-masing untuk KEX2-650 dan KEX2-620. Setelah dilakukan restriksi dengan BamHI dan ligasi, pD902-KEX2-650 dan pD902-KEX2-620 diintroduksi kembali ke E. coli DH5α. Hasil analisis menunjukkan plasmid rekombinan telah berhasil diintroduksi ke dalam E. coli DH5α. Verifikasi PCR dari gen target menunjukkan bahwa satu dari beberapa koloni transforman KEX2-650 yang diperoleh memiliki amplikon yang sesuai dengan panjang yang diharapkan, yaitu sekitar 646 pb. Namun, koloni KEX2-620 tidak menghasilkan amplikon dengan ukuran yang sesuai target (556 pb). Hasil analisis sekuensing DNA dari klon KEX2-650 terpilih, mengkonfirmasi bahwa domain transmembran telah terdelesi dari konstruk gen untuk membentuk konstruk KEX2-650.