Konstruksi Vektor Ekspresi Gen KEX2-650 dan KEX2-620 Saccharomyces cerevisiae Pada Escherichia coli DH5α
Date
2022Author
Adibah, Denabela Iftina
Budiarti, Sri
Fuad, Asrul Muhamad
Metadata
Show full item recordAbstract
Kex2 merupakan protease spesifik (EC3.4.21.61) asal Saccharomyces cerevisiae
yang memiliki fungsi mirip dengan furin pada mamalia dan memiliki homologi sekuen
sebesar 47%. Kex2 secara alami merupakan protein intraselular sebagai protein
transmembran, khususnya ditemukan pada membran retikulum endoplasmik dan trans golgi. Kex2 merupakan serin-protease yang mengikat ion Ca2+. Protein ini berperan
dalam proses pemotongan protein prekursor pheromone mating-factor-α dan killer toxin
M1 pada situs spesifik dimana dijumpai pasangan asam amino basa Lys-Arg atau Arg Arg saat protein tersebut dikirim keluar sel melalui jalur sekresi. Fungsi unik Kex2
dalam konversi prepro-protein menjadi protein matang, banyak dimanfaatkan seperti
untuk pematangan proinsulin glargine menjadi glargine matang. Hal ini membuat
pemilihan sistem ekspresi Kex2 secara ekstraselular pada pengoptimasian proses
konversi akan sangat menguntungkan untuk optimasi proses konversi. Kex2
ekstraselular dapat diperoleh melalui rekayasa genetik, seperti delesi transmembran
domain. Penelitian ini bertujuan mengkonstruksi varian vektor pD902-KEX2 dengan
mengoptimalkan strategi modifikasi penghapusan daerah terminal-C termasuk domain
transmembran dan Ser/Thr dari sekuen gen KEX2, serta introduksinya ke dalam
Escherichia coli DH5α. Varian KEX2 yang dikonstruksi adalah KEX2-650 (tanpa
domain transmembran) dan KEX2-620 (tanpa domain Ser/Thr dan domain
transmembran). Plasmid rekombinan dikonstruksi melalui metode mutagenesis terarah
dengan teknik PCR terhadap vektor pD902-KEX2-699 menggunakan pasangan primer
FP-Kex2-699/RP-Kex2-650 dan FP-Kex2-699/RP-Kex2-620, masing-masing untuk
KEX2-650 dan KEX2-620. Seluruh primer untuk mutagenesis terarah yang digunakan
mengandung situs BamHI untuk religasi plasmid. Proses PCR pada mutagenesis terarah
menghasilkan amplikon DNA dengan panjang sesuai yang diharapkan, yaitu sekitar
5551 pb dan 5461 pb masing-masing untuk KEX2-650 dan KEX2-620. Setelah
dilakukan restriksi dengan BamHI dan ligasi, pD902-KEX2-650 dan pD902-KEX2-620
diintroduksi kembali ke E. coli DH5α. Hasil analisis menunjukkan plasmid rekombinan
telah berhasil diintroduksi ke dalam E. coli DH5α. Verifikasi PCR dari gen target
menunjukkan bahwa satu dari beberapa koloni transforman KEX2-650 yang diperoleh
memiliki amplikon yang sesuai dengan panjang yang diharapkan, yaitu sekitar 646 pb.
Namun, koloni KEX2-620 tidak menghasilkan amplikon dengan ukuran yang sesuai
target (556 pb). Hasil analisis sekuensing DNA dari klon KEX2-650 terpilih,
mengkonfirmasi bahwa domain transmembran telah terdelesi dari konstruk gen untuk
membentuk konstruk KEX2-650.