Identifikasi dan Karakterisasi Molekuler Simian Endogenous Retrovirus pada Macaca fascicularis dan Macaca nemestrina di Fasilitas Penangkaran di Bogor

Abstract

Macaca fascicularis (monyet ekor panjang, MEP) dan M. nemestrina (beruk) merupakan satwa primata endemik Indonesia yang digunakan sebagai hewan model dalam penelitian biomedis untuk menunjang kesehatan manusia, salah satunya pada penelitian pengembangan vaksin Human immunodeficiency virus (HIV). Vaksin konvensional HIV yang telah dikembangkan saat ini tidak efektif akibat tingginya keragaman retrovirus eksogen. Studi terbaru telah dilakukan pendekatan pengembangan jenis vaksin HIV dengan memanfaatkan Human endogenous retrovirus (HERV). HERV juga diketahui menginduksi respon kekebalan, sehingga memungkinkan untuk dilakukan pengembangan terapi terhadap HERV untuk pencegahan kanker. Retrovirus endogen juga ditemukan pada satwa primata salah satunya yaitu Simian endogenous retrovirus (SERV), sehingga retrovirus endogen pada satwa primata ini diharapkan dapat mendukung dalam penelitian vaksin HIV maupun terapi anti-kanker pada manusia. Penelitian dasar berupa identifikasi dan karakterisasi molekuler terhadap retrovirus endogen pada satwa primata Indonesia yang terdeteksi pada sampel MEP dan beruk perlu dilakukan. Penelitian memanfaatkan 131 sampel darah utuh asal MEP dan 58 sampel asal beruk dikoleksi dari Fasilitas Penangkaran Wanara Satwa Loka (WSL) dan PSSP-LPPM IPB di Bogor. Amplifikasi PCR pada sampel DNA dilakukan dengan teknik real-time PCR SYBR Green menggunakan primer spesifik SRV1-5 7585U19 dan SRV1-5 7695L21. Analisis hasil amplifikasi didasarkan pada profil nilai cycle threshold (Ct) <24,0 dan nilai kurva leleh (melt curve) pada suhu kisaran 80,0-82,0ºC. Runutan nukleotida genom utuh dilakukan dengan teknik sekuensing asam nukleat menggunakan metode primer walking dan dianalisis dengan metode bioinformatik yaitu 4peaks, clustalW dan BLAST (NCBI). Pohon filogenetik dikonstruksi dengan metode neighbor-joining menggunakan program MEGA X. Berdasarkan uji tapis dengan teknik real-time PCR SYBR Green, diperoleh dua sampel yang memiliki karakeristik SERV yaitu Mn B1 dan Mn B140910 dengan nilai Tm 82,0ºC dan nilai Ct 22,37-22,54. Analisis runutan genom utuh terhadap dua sampel SERV tersebut diperoleh hasil yang identik dengan total 7991 nukelotida yang disusun atas domain LTR, gag, prt, pol, dan env. Kedua sampel ini memiliki kemiripan (identity) nukleotida 99-100% dengan isolat sampel beruk Mn 92227 asal Indonesia yang berada di Pusat Primata Nasional Universitas Washington (NaPRC UW) sejak tahun 1998 yang terkonfirmasi sebagai novel SERV. Gambaran hasil pohon filogenetik menunjukkan sampel Mn B1 dan Mn B140910 pada genom utuh nukleotida dan asam amino env mengelompok bersama SRV-2 dengan identitas nilai 82% dan 79%, sementara itu asam amino Gag, Prt, dan Pol mengelompok bersama SRV-1, -3, -4, -5, dan -8 dengan identitas 82-88%. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa kedua sampel yang diperoleh merupakan novel SERV asal beruk. Data genetik SERV pada beruk asal Indonesia ini dapat menjadi penelitian dasar dan pertimbangan penggunaan satwa primata sebagai model in vivo yang dapat menunjang perkembangan vaksin HIV dan terapi anti-kanker pada manusia.

Macaca fascicularis (long-tailed macaque, MEP) and M. nemestrina (pig-tailed macaque, beruk) are non-human primates commonly used as laboratory animals in biomedical research to support the human health, among others are the in vivo testing for the development of HIV-1 vaccine. Recent studies have explored approaches to HIV vaccine by utilizing Human endogenous retrovirus (HERV) due to the hypervariability of exogenous retroviruses which causes conventional vaccines to be ineffective. HERV is also known induces an immune response, so it is possible to develop therapies against HERV for cancer prevention. Endogenous retroviruses were also found in non-human primates namely Simian endogenous retrovirus (SERV). This non human primate endogenous retroviruses in primates are expected to support research on HIV vaccines and anti-cancer therapy in humans. The aim of this study was to identify and characterize using molecular approach to the simian endogenous retrovirus isolated from Indonesian non-human primates. As much as 131 whole blood samples from long-tailed macaques and 58 samples of pig-tailed macaques were collected from Wanara Satwa Loka (WSL) and PSSP-LPPM IPB breeding facilities in Bogor. PCR amplification of DNA samples was carried out using the SYBR Green real-time PCR technique with specific primers SRV1-5 7585U19 and SRV1-5 7695L21. The amplification results of positive SERV were analyzed based on the cycle threshold (Ct) values less than 24,0 and melting temperature (Tm) values in the range of 80,0-82,0ºC. Whole-genome nucleotide sequences were performed by nucleic acid sequencing technique using the walking primer method and analyzed by bioinformatics programs such as 4peaks, clustalW, and BLAST (NCBI). The phylogenetic tree was constructed using the neighbor-joining method using MEGA X program. Based on SYBR Green real-time PCR amplification results indicated that two pig-tailed macaque samples (Mn B1 and Mn B140910) were positive to SERV with the Ct values at 22,37-22,54 and Tm values at 82,0ºC. Whole genome sequences of SERV positive samples resulted 7991 nucleotides length that identic among of these samples and consisted of LTR, gag, prt, pol, and env genes. Both of these samples had 99-100% nucleotide identities compared to Mn 92227 isolate at National Primate Center University of Washington (NaPRC UW) that imported from Indonesia in 1998, which was confirmed as novel SERV. The phylogenetic tree results showed that SERV samples of whole nucleotide genome and env amino acids clustered with SRV-2 with identity values of 82% and 79%, and also has 99-100% identity with Mn 92227. Meanwhile, the Gag, Prt, and Pol amino acids clustered together with SRV-1, -3, -4, -5, and -8 with identity values in the range of 82-88%. Therefore, we assumed that both of these samples were novel SERV form pig-tailed macaques.