Sekuens DNA Genom Growth Hormone dan Insulin-like Growth Factor-1 serta Asosiasinya dengan Pertumbuhan Ikan Gurami

Abstract

Laju pertumbuhan ikan gurami lebih rendah dibandingkan komoditas air tawar lainnya, sehingga membutuhkan waktu pembesaran yang relatif lebih lama. Masa panen dapat dipersingkat dengan penggunaan benih unggul ikan gurami tumbuh cepat. Benih tersebut dapat dihasilkan melalui seleksi ikan berbasis DNA dengan marka single nucleotide polymorphism (SNPs). Informasi marka SNPs untuk membedakan ikan gurami tumbuh cepat dan tumbuh lambat saat ini belum tersedia. Gen growth hormone (GH) dan insulin-like growth factor-1 (IGF1) banyak dilaporkan menjadi kandidat marka SNPs dalam seleksi berbasis DNA, dan berpotensi juga digunakan pada seleksi ikan gurami. Tujuan penelitian ini adalah memisahkan populasi gurami tumbuh cepat (fast growth, FG) dan lambat (slow growth, SG), mengidentifikasi sekuens dan SNPs pada DNA genom GH dan IGF1, serta membandingkan variasi dan frekuensi SNPs pada alel tertentu dari populasi tumbuh cepat dan lambat.

Benih ikan gurami berumur 25 hari dipelihara dalam ruangan menggunakan akuarium berukuran 100×40×40 cm3. Padat tebar ikan masing-masing akuarium 1250 ekor m−2 atau 500 ekor setiap akuarium. Pakan cacing sutra diberikan sebanyak tiga kali sehari secara at satiation (hingga kenyang) pada umur 25-65 hari. Ikan yang telah berumur 55 hari, kemudian dipisahkan berdasarkan sebaran bobot. Ikan populasi FG dipisahkan dari populasi dengan 20 % bobot tertinggi, dan SG dari 20 % populasi ikan dengan bobot terendah. Kedua populasi dipelihara secara terpisah hingga umur 85 hari secara outdoor pada bak beton berukuran 2×3×1 m3 dengan padat tebar ikan sebesar 100 ekor m−2. Pakan cacing sutra dan pakan komersial dengan kadar protein 39-41 % diberikan tiga kali sehari secara at satiation. Setelah berumur 85 hari, masing-masing populasi dipindahkan pada hapa ke kolam terpal dengan ukuran hapa 2×4×1.2 m3 dengan padat tebar ikan sebesar 50 ekor m−2. Ikan dipelihara hingga berumur 145 hari. Pemeliharaan dilanjutkan hingga ikan berumur 200 hari. Pakan komersial dengan kadar protein 39-41 % dan daun sente diberikan tiga kali sehari secara at satiation. Pertumbuhan panjang dan bobot ikan dianalisis setiap satu bulan. Analisis tingkat ekspresi gen GH dan IGF1 dilakukan dengan metode real-time PCR. Tingkat ekspresi gen dianalisis pada ikan FG dan SG yang dipuasakan selama 24 jam pada ikan umur 85 hari. Isolasi RNA untuk analisis ekspresi gen menggunakan jaringan hati dan otak ikan gurami berumur 85 hari diambil pada jam ke-0 (sebelum pemberian pakan), jam ke-3, dan jam ke-6 setelah pemberian pakan. Identifikasi sekuens DNA genom GH dan IGF1 serta marka SNPs dilakukan dengan metode polymerase chain reaction (PCR). Isolasi DNA dilakukan menggunakan sirip ekor yang dipotong dari 100 ekor ikan gurami populasi FG dan SG yang telah berumur 85 hari. Sebanyak 23 sampel DNA hasil amplifikasi dari masing-masing populasi dianalisis dengan metode sekuensing untuk mengetahui urutan sekuens DNA genom GH dan IGF1. Urutan sekuens DNA hasil amplifikasi dianalisis untuk membedakan variasi nukleotida SNPs pembeda antara FG dengan SG.

Hasil menunjukkan populasi FG memiliki rata-rata bobot 3.88 pada umur 55 hari, 3.06 pada umur 85 hari, 2.06 pada umur 115 hari, 1.60 pada umur 145 hari, dan 2 kali lebih tinggi pada umur 200 hari dibandingkan populasi SG. Rata-rata bobot dan panjang populasi FG konsisten lebih tinggi hingga umur 200 hari. Sebaran ukuran populasi FG juga konsisten lebih besar dari umur 55 hari sampai 200 hari dibandingkan populasi SG. Laju pertumbuhan spesifik dan pertumbuhan bobot mutlak populasi FG 1.6 kali lebih tinggi dibandingkan populasi SG. Hasil analisis tingkat ekspresi gen GH dan IGF1 menunjukkan populasi FG signifikan lebih tinggi dibandingkan SG sehingga berpotensi dievaluasi sebagai marka ikan gurami tumbuh cepat.

Sekuens DNA GH berhasil diidentifikasi sepanjang 1598 bp terdiri atas lima ekson dan empat intron. Terdapat tiga SNPs pada genom GH, yaitu SNP1 (g.141 G>C) yang terletak pada ekson 1; SNP2 (g.1206 G>C) dan SNP3 (g.1220 G>A) yang terletak pada ekson 4. Namun demikian seluruh SNPs tersebut tidak menunjukkan korelasi signifikan dengan pertumbuhan ikan gurami. Sekuens basa nukleotida pada bagian 5’-Untranslated Region (5'-UTR) hingga ekson 2 dari genom IGF-1 ikan gurami berhasil diidentifikasi sepanjang 1989 bp. Terdapat lima SNPs IGF1 pembeda pada populasi FG dan SG. Lima SNPs tersebut yaitu SNP1 (g.191 G>T) dan SNP2 (g.213 A>G) yang terletak pada ekson 1; SNP3 (g.793 T>G), SNP4 (g.1052 A<G), SNP5 (g.1340 A<T) yang terletak pada intron 1. SNP1, SNP2, dan SNP3 tidak berkorelasi signifikan dengan kedua populasi, sedangkan SNP4 dan SNP5 berkorelasi signifikan dengan kedua populasi. Selanjutnya hasil analisis korelasi SNP4 dan SNP5 dengan pertumbuhan menunjukkan genotipe AA dan TT SNP5 IGF1 menunjukkan perbedaan signifikan pada panjang ikan. Kombinasi SNP4 dan SNP5 IGF1 menunjukkan perbedaan yang signifikan pada kedua populasi. Hasil analisis korelasi kombinasi SNP4 dan SNP5 IGF1 dengan frekuensi ikan menunjukkan perbedaan yang signifikan pada kedua populasi. Hasil analisis korelasi kombinasi SNP4 dan SNP5 gen IGF1 dengan pertumbuhan menunjukkan Var1 menunjukkan perbedaan panjang dan bobot yang signifikan. Hal tersebut menunjukkan Var1 gen IGF1 berpotensi dipilih sebagai marka ikan gurami tumbuh cepat.

The growth rate of giant gouramy is lower than other freshwater commodities, so it requires a relatively longer rearing time. The harvest period can be shortened by using superior larvae of fast growing gourami. These fish can be produced through DNA-based fish selection by using single nucleotide polymorphism (SNPs). However, no information on molecular markers that differentiated fast growth (FG) and slow growth (SG) from giant gourami was available. Growth hormone (GH) and insulin-like growth factor-1 (IGF1) genes have been widely reported to be candidate markers for SNPs in DNA-based selection, and have the potential to be used in Giant gouramy selection. Thus, the aims of this study are to separate the fast growth (FG) and slow growth (SG) Giant gouramy populations, identify sequences and SNPs in the DNA of the GH and IGF1 genes, and compare the variation and frequency of SNPs in certain alleles from fast and slow growing populations. Fish larvae at 25 days old are reared indoors for 30 days in 100×40×40 cm3 glass tanks (1250 fish m−2; 500 fish/tanks). Fish were fed with freeze-dried worms thrice daily at satiation at 25 days old until 65 days old. The 55 days old fish separated based on the distribution of weight. The FG population fish were separated from the population with the highest 20 % body weight and slow growth (SG) from the 20 % fish population with the lowest body weight. Then, both populations are reared separately until at 85 days old outdoors in 2×3×1 m3 tanks (100 fish m−2). Freeze-dried worms and commercial feed (39-41 % protein) were given thrice daily at satiation. At 85 days old, fish were transferred separately into 2×4×1.2 m3 hapas inside the outdoor HDPE-lined (high-density polyethylene) ponds. Fish are reared until 145 days old, and it continued until 200 days old. Commercial feed (39-41 % protein) and sente leaves were given thrice daily at satiation. Fish growth was analyzed by measuring body length and body weight monthly. Gene expression level was analyzed by real-time PCR. For gene expression analysis, fish from FG and SG have fasted for 24 hours at 85 days old fish. Isolation of RNA for gene expression analysis using liver and brain were taken before re-feeding, and 3 and 6 hours after re-feeding. Isolation of DNA was carried out using caudal fin that was cut from 100 fish each population at 85 days old fish. A total of 23 amplified DNA samples from each population were analyzed by sequencing methods to determine the sequence of GH and IGF1 genomic DNA sequences. Genomic identification of GH and SNP was carried out using polymerase chain reaction (PCR). The amplified DNA was sequenced to analyze for the differentiating of nucleotide variations on FG and SG. The results showed that the FG population had an average body weight of 3.88 at 55 days old, 3.06 at 85 days old, 2.06 at 115 days old, 1.60 at 145 days old, and 2 times higher at 200 days old than the SG population. The average body weight and body length of FG were consistently higher until 200 days old. The size distribution of FG was also consistently larger from 55 days old until 200 days old than SG. The specific growth rate and growth rate of FG were 1.6 times higher than SG. Gene expression levels of GH and IGF1 on FG are significantly higher, thus it’s potential to evaluate as giant gourami fast growing’s marker candidate. The GH genome was identified 1598 bp, it consists of five exons and four introns. There were three SNPs GH gene in FG and SG. They are SNP1 (g.141 G>C)in exon 1; SNP2 (g.1206 G>C) and SNP3 (g.1220 G>A) in exon 4, but it’s not significant difference. The IGF1 genome in 5’Untranslated Region (5UTR) until exon 2 were identified 1989 bp. There were five SNPs in the IGF1 gene that differentiate the FG and SG populations. They are SNP1 (g.191 G>T) and SNP2 (g.213 A>G) in exon 1; SNP3 (g.793 T>G), SNP4 (g.1052 A<G), SNP5 (g.1340 A<T) in intron 1. The SNP1, SNP2, and SNP3 were not significantly correlated with both populations, while SNP4 and SNP5 were significantly correlated with both populations. Furthermore, the result of the correlated analysis of SNP4 and SNP5 with growth showed that the genotypes of AA and TT SNP5 IGF1 showed significant differences in fish body length. The combination of SNP4 and SNP5 IGF1 showed significant differences in both populations. The result of correlation analysis of the combination of SNP4 and SNP5 IGF1 with fish frequency showed significant differences in both populations. The result of the correlation analysis of the combination of SNP4 and SNP5 IGF1 with growth showed Var1 showed significant differences in body weight and length. This shows that Var1 of the IGF1 gene have may be chosen as a marker for fast-growing Giant gouramy.