Sintesis Lipida Kaya 1,3-Dioleoyl-2-Palmitoyl-Glycerol (OPO) dari Hard Palm Stearin

Abstract

Human milk fat (HMF) merupakan lemak yang terkandung pada air susu ibu, yang mengandung 20–30% asam palmitat, dimana 60–70% asam palmitat terdistribusi pada posisi stereospesific number (sn)-2 dalam struktur triasilgliserol (TAG). Human milk fat substitute (HMFS) merupakan lipida terstruktur menyerupai HMF, yang disintesis melalui interesterifikasi enzimatis minyak atau lemak. Karakter utama HMFS adalah asam palmitat terletak pada posisi sn-2 dan asam lemak tak jenuh terletak pada posisi sn-1,3. HMFS yang umum disintesis adalah 1,3-dioleoyl-2-palmitoyl-glycerol (OPO), yang merupakan TAG utama pada HMF. TAG tersebut bermanfaat untuk bayi karena dapat membantu penyerapan lemak dan kalsium secara efektif. Hard palm stearin (HPS) merupakan fraksi padat hasil fraksinasi palm stearin (PS), yang secara alami mengandung asam palmitat dan tripalmitin (PPP) tinggi. Selain memiliki jumlah PPP yang tinggi, HPS juga mengandung TAG dengan asam oleat pada posisi sn-2. TAG dengan asam oleat pada posisi sn-2 diasidolisis dengan asam oleat menggunakan lipase spesifik sn-1,3 akan menghasilkan triolein (OOO), yang bukan produk target dalam sintesis HMFS. Oleh karena itu, rute sintesis HMFS menggunakan HPS harus dimulai dengan peningkatan fraksi lipida yang kaya TAG dengan asam palmitat pada posisi sn-2. Kemudian, asam lemak pada posisi sn-1,3 dari fraksi lipida yang kaya TAG dengan asam palmitat pada posisi sn-2 HPS diganti dengan donor asil tertentu seperti asil oleat melalui asidolisis atau transesterifikasi. Tujuan utama dari penelitian ini adalah mensintesis lipida kaya OPO berbahan baku HPS. Tujuan umum tersebut dicapai dengan beberapa tahapan penelitian antara lain: (1) peningkatan fraksi lipida yang kaya TAG dengan asam palmitat pada posisi sn-2 HPS melalui fraksinasi aseton dan interesterifikasi enzimatis menggunakan donor palmitat, seperti asam palmitat atau etil palmitat dalam sistem bebas pelarut; (2) penentuan kondisi reaksi optimum pada sintesis OPO melalui transesterifikasi enzimatis antara fraksi lipida yang kaya TAG dengan asam palmitat pada posisi sn-2 dari HPS dan etil oleat dalam sistem bebas pelarut; dan (3) peningkatan lipida kaya OPO melalui fraksinasi produk transesterifikasi enzimatis antara fraksi lipida yang kaya TAG dengan asam palmitat pada posisi sn-2 dari HPS dan etil oleat. Disertasi ini disusun secara sistematik sesuai tahapan penelitian. Pada bagian awal mengulas sintesis HMFS secara komprehensif. Pada bagian kedua, fraksi lipida yang kaya TAG dengan asam palmitat pada posisi sn-2 dari HPS ditingkatkan melalui fraksinasi aseton HPS. Pada bagian ketiga, fraksi lipida yang kaya TAG dengan asam palmitat pada posisi sn-2 ditingkatkan melalui asidolisis HPS dengan asam palmitat atau transesterifikasi HPS dengan etil palmitat. Pada bagian keempat, sintesis OPO dilakukan melalui transesterifikasi antara fraksi lipida yang kaya TAG dengan asam palmitat pada posisi sn-2 dari HPS dan etil oleat. Pada bagian terakhir, produk transesterifikasi antara fraksi lipida yang kaya TAG dengan asam palmitat pada posisi sn-2 dari HPS dan etil oleat difraksinasi untuk meningkatkan lipida kaya OPO. Pada fraksinasi aseton HPS diperoleh fraksi padat yang kaya TAG dengan asam palmitat pada posisi sn-2 (PPP dan PPS) yang meningkat. Peningkatan rasio aseton terhadap HPS dan suhu fraksinasi meningkatkan kadar PPP+PPS namun menurunkan rendemen PPP+PPS. Kondisi fraksinasi optimum untuk menghasilkan lipida kaya PPP+PPS adalah pada rasio HPS terhadap aseton 1:5 (g/ml) dan suhu fraksinasi 30 °C selama 3 jam. Pada kondisi tersebut, lipida yang diperoleh memiliki kadar dan rendemen PPP+PPS masing-masing lebih dari 91% dan 59%. Lipida yang diperoleh terdiri dari asam palmitat 91,32% dan pada posisi sn-2 88,13%. Pada interesterifikasi enzimatis HPS dihasilkan fraksi lipida yang kaya TAG dengan asam palmitat pada posisi sn-2 tertinggi pada rasio mol HPS terhadap donor palmitat 1:3, suhu 65 °C, Novozyme 435 10% dari berat substrat, dan waktu reaksi selama 4 jam. Etil palmitat merupakan donor palmitat yang menghasilkan fraksi lipida yang kaya TAG dengan kadar asam palmitat pada posisi sn-2 (88,44%) tertinggi dibandingkan asam palmitat (83,92%). Peningkatan lipida yang kaya TAG dengan asam palmitat pada posisi sn-2 melalui fraksinasi aseton HPS dan transesterifikasi enzimatis antara HPS dan etil palmitat menghasilkan fraksi lipida yang kaya TAG dengan kadar asam palmitat pada posisi sn-2 pada tingkat yang sama yaitu lebih dari 88%. Namun, produk transesterifikasi mengandung kadar asam lemak bebas (ALB) dan diasilgliserol (DAG) yang lebih tinggi dibandingkan produk fraksinasi. Kadar DAG yang tinggi dapat menyebabkan migrasi asil pada interesterifikasi enzimatis yang dapat memengaruhi produk target (OPO) yang akan dihasilkan. Sehingga diperlukan proses purifikasi produk transesterifikasi untuk menghilangkan ALB dan DAG, yang dapat menyebabkan peningkatan biaya produksi. Dengan demikian, fraksi lipida yang kaya TAG dengan asam palmitat pada posisi sn-2 yang dihasilkan melalui fraksinasi aseton dipilih sebagai substrat dalam sintesis lipida kaya OPO. Pada transesterifikasi enzimatis antara fraksi lipida yang kaya TAG dengan asam palmitat pada sn-2 dari HPS dengan etil oleat diperoleh lipida terstruktur yang mengandung OPO+POO sebagai TAG utama. Peningkatan rasio mol etil oleat terhadap fraksi lipida yang kaya TAG dengan asam palmitat pada posisi sn-2 dari HPS dan waktu reaksi menurunkan kadar PPP dan PPS. Pada rasio mol fraksi lipida yang kaya TAG dengan asam palmitat pada posisi sn-2 dari HPS terhadap etil oleat sebesar 1:6, suhu 60 °C dan waktu reaksi 2 jam menghasilkan lipida terstruktur mengandung OPO+POO 41,13%, dengan asam palmitat total 51,09%, asam palmitat pada posisi sn-2 75,76%, asam oleat total 44,48%, dan asam oleat pada posisi sn-1,3 58,77%. Pada fraksinasi produk transesterifikasi dihasilkan fraksi cair dengan kadar OPO+POO dan PPO+POP yang meningkat. Fraksinasi pada 10 °C selama 3 jam menghasilkan fraksi cair mengandung OPO+POO 43,72% dan PPO+POP 51,03%. Pada kondisi tersebut, lipida yang diperoleh memiliki kadar asam palmitat pada posisi sn-2 dan asam oleat pada posisi sn-1,3 masing-masing sebesar 79,57% dan 68,93%, dengan kadar relatif asam palmitat pada posisi sn-2 sebesar 59,07%.

Human milk fat (HMF) is fat contained in breast milk, which contains 20–30% palmitic acid, 60–70% palmitic acid is distributed at the stereospecific number (sn)-2 position in the triacylglycerol (TAG). Human milk fat substitute (HMFS) is a structured lipid similar to HMF, synthesized by enzymatic interesterification of oils or fats. The main character of HMFS is that palmitic acid is located at the sn-2 position, and unsaturated fatty acids are located at the sn-1,3 positions. The most commonly synthesized HMFS is 1,3-dioleoyl-2-palmitoyl-glycerol (OPO), which is the main TAG of HMF. OPO is beneficial for babies because it can help in the effective absorption of fat and calcium. Hard palm stearin (HPS) is a solid fraction resulting from the fractionation of palm stearin (PS), which naturally contains high palmitic acid and tripalmitin (PPP). In addition to having a high amount of PPP, HPS also contains TAG with oleic acid at the sn-2 position. TAG with oleic acid at the sn-2 position is acidolyzed with oleic acid using sn-1,3 specific lipase produces triolein (OOO), which is not the target product in HMFS synthesis. Thus, the HMFS synthesis route using HPS should be initiated by increasing TAG-rich lipid fraction with palmitic acid at sn-2 position. Then, fatty acids at sn-1,3 positions of the TAG-rich lipid fraction with palmitic acid at sn-2 position of HPS are replaced with a specific acyl donor such as acyl oleic by acidolysis or transesterification. The main objective of this study was to synthesize lipids rich in OPO using HPS. This general goal was achieved by several stages of research, including (1) increasing TAG-rich lipid fraction with palmitic acid at sn-2 position of HPS by acetone fractionation and enzymatic interesterification using palmitic donors, such as palmitic acid or ethyl palmitate in a solvent-free system; (2) determination of the optimum reaction conditions in the synthesis of OPO by enzymatic transesterification between TAG-rich lipid fraction with palmitic acid at sn-2 position of HPS and ethyl oleate in a solvent-free system; and (3) increase lipids rich in OPO by fractionation of enzymatic transesterification product between TAG-rich lipid fraction with palmitic acid at sn-2 position of HPS and ethyl oleate. This dissertation is arranged systematically to follow the research stages. In the first chapter, the comprehensive review of HMFS synthesis. In the second chapter, TAG-rich lipid fraction with palmitic acid at sn-2 position of HPS was enhanced by HPS acetone fractionation. The third chapter enhanced TAG-rich lipid fraction with palmitic acid at sn-2 position of HPS by acidolysis of HPS with palmitic acid or transesterification of HPS with ethyl palmitate. In the fourth chapter, OPO synthesis was carried out by transesterification between TAG-rich lipid fraction with palmitic acid at sn-2 position of HPS and ethyl oleate. In the last chapter, the transesterified product between TAG-rich lipid fraction with palmitic acid at sn-2 position of HPS and ethyl oleate was fractionated to increase lipids rich in OPO. In HPS acetone fractionation, the solid fraction containing TAG-rich lipid fraction with palmitic acid at sn-2 position (PPP and PPS) increased. The increase in the ratio of HPS to acetone and the fractionation temperature increased the contents of PPP+PPS but decreased the yield of PPP+PPS. The optimum fractionation conditions to produce lipids rich in PPP+PPS were at a ratio of HPS to acetone of 1:5 (g/ml) and a fractionation temperature of 30 °C for 3 h. With these conditions, lipids obtained had PPP+PPS content and yield of more than 91% and 59%, respectively. Lipids obtained consisted of palmitic acid 91.32% and at sn-2 position 88.13%. In HPS enzymatic interesterification, TAG-rich lipid fraction with the highest palmitic acid at sn-2 position was produced at a mole ratio of HPS to palmitate donor of 1:3, the temperature of 65 °C, Novozyme 435 10% by weight of the substrate, and time reaction for 4 h. Ethyl palmitate was a palmitic donor that produced a TAG-rich lipid fraction with the highest palmitic acid content at sn-2 position (88.44%) compared to palmitic acid (83.92%). The increase in TAG-rich lipid fraction with palmitic acid at sn-2 position through the fractionation of HPS acetone and enzymatic transesterification between HPS and ethyl palmitate resulted in TAG-rich lipid fraction with palmitic acid at sn-2 position at the same level of more than 88%. However, the transesterification product contained higher free fatty acid (FFA) and diacylglycerol (DAG) than the fractionated product. High levels of DAG can cause acyl migration in enzymatic interesterification, which can affect the target product (OPO) that will be produced. Therefore, a transesterification product purification process is needed to remove FFA and DAG, increasing production costs. Thus, TAG-rich lipid fraction with palmitic acid at sn-2 position generated by acetone fractionation was chosen as a substrate in synthesizing OPO-rich lipids. In enzymatic transesterification between TAG-rich lipid fraction with palmitic acid at sn-2 position and ethyl oleate, a structured lipid was obtained containing OPO+POO as the main TAG. Increasing the substrate mole ratio of ethyl oleate to TAG-rich lipid fraction with palmitic acid at sn-2 position of HPS and reaction time decreased the contents of PPP and PPS. At a mole ratio of TAG-rich lipid fraction with palmitic acid at sn-2 position of HPS to ethyl oleate of 1:6, a temperature of 60 °C, and a reaction time of 2 h resulted in structured lipids containing 41.13% OPO+POO, with total palmitic acid of 51.09%, palmitic acid at sn-2 position of 75.76%, total oleic acid of 44.48%, and oleic acid at sn-1,3 positions of 58.77%. In the fractionation of the transesterification product, a liquid fraction was produced with increased contents of OPO+POO and PPO+POP. Fractionation at 10 °C for 3 h resulted in a liquid fraction containing 43.72% OPO+POO and 51.03% PPO+POP. With these conditions, the lipid obtained consisted of palmitic acid at sn-2 position and oleic acid at sn-1,3 positions contents of 79.57 % and 68.93%, respectively, with a relative content of palmitic acid at sn-2 position of 59.07%.