Purifikasi dan Karakterisasi Lakase dan Mangan Peroksidase (MnP) asal Trametes hirsuta LBF AA017 serta Aplikasinya dalam Mendegradasi Melanin

Abstract

Melanin merupakan pigmen kompleks alami yang bertanggung jawab terhadap warna gelap pada kulit manusia. Standar kecantikan dunia seperti di negara-negara Afrika, Asia, dan Karibia ialah memiliki kulit cerah sehingga permintaan produk-produk kecantikan seperti kosmetik dan produk perawatan kulit yang mengandung agen pemutih kulit meningkat. Selain keuntungan, peningkatan minat pada produk-produk tersebut juga menimbulkan masalah baru bagi masyarakat, yaitu bahan berbahaya yang digunakan sebagai agen pemutih kulit. Oleh karenanya, penelitian terkait mencari agen pemutih yang aman bagi kulit banyak dikembangkan, antara lain agen pemutih kulit alami secara enzimatik menggunakan cendawan. Enzim ligninolitik adalah enzim oksidatif potensial yang secara efektif dihasilkan oleh cendawan, misalnya cendawan pelapuk putih (white-rot fungi). Enzim ini didominasi oleh beberapa enzim, seperti lakase dan mangan peroksidase yang memiliki kemampuan untuk mendegradasi kelompok senyawa fenolik, aromatik, dan lignin dalam lingkup yang luas. Melanin adalah senyawa biopolimer nonfenolik yang bermolekul besar. Kemiripan struktur dan komposisi antara lignin dan melanin menjadikan melanin diduga dapat dioksidasi juga oleh enzim ligninolitik, Isolat yang digunakan pada penelitian ialah Trametes hirsuta LBF AA017. Enzim yang dihasilkan oleh isolat tersebut ialah lakase dan mangan peroksidase. Aktivitasnya yang besar pada penelitian sebelumnya dalam mengoksidasi biomasa yaitu serbuk batang sorgum 4183A menjadikan enzim-enzim tersebut diduga berpotensi untuk diaplikasikan sebagai agen pemutih kulit. Tujuan dari penelitian ini ialah mendeteksi kemampuan lakase dan mangan peroksidase asal T. hirsuta LBF AA017 hasil pemurnian dalam mendegradasi melanin. Hasil penelitian yang peroleh diharapkan dapat dijadikan sebagai referensi untuk penelitian lanjutan dalam memproduksi agen pemutih kulit. Enzim ligninolitik (Lakase - Mangan Peroksidase) yang diisolasi dari T. hirsuta LBF AA0017 telah berhasil dipurifikasi secara parsial dengan beberapa tahapan, antara lain melalui pengendapan dengan amonium sulfat 80%, dialisis, ultrafiltrasi, dan kromatografi penukar anion kolom Q Sepharose Fast Flow (QFF) menggunakan AKTAprime plus. Proses purifikasi telah menghasilkan peningkatan kemurnian lakase sebesar 16x lipat dengan aktivitas spesifik dan rendemen akhir berturut-turut adalah 74,4 U/mg dan 6,8%. Sedangkan purifikasi MnP menghasilkan peningkatan kemurnian sebesar 14x lipat dengan aktivitas spesifik dan rendemen akhir masing-masing sebesar 7,3 U/mg dan 6,8%. Karakterisasi terhadap lakase dan mangan peroksidase juga telah dilakukan. Lakase dan mangan peroksidase dalam penelitian memiliki bobot molekul masing-masing pada kisaran 60-70 kDa dan 50-60 kDa. Kedua enzim tersebut terlihat aktivitasnya pada analisis zimogram. Efektivitas enzim ligninolitik (lakase-MnP) dalam mendegradasi melanin terlihat dengan adanya penambahan mediator kombinasi yaitu TEMPO-MnSO4.H2O2 yang mengindikasikan bahwa kedua enzim dibantu kinerjanya dalam mengoksidasi melanin oleh mediatornya masing-masing. Selain itu, aktivitas degradasi melanin menjadi lebih efektif dengan menggunakan konsentrasi enzim yang tinggi, yaitu lakase 22,5 U dan MnP 9 U. Perubahan morfologi permukaan dan struktur melanin pada peregangan O-H dan N-H pada melanin juga terbukti melalui FTIR-UATR dan FE-SEM. Kemampuan kedua enzim yang dapat mendegradasi melanin menjadikan enzim lakase dan MnP asal T. hirsuta LBF AA017 berpotensi dijadikan sebagai kandidat agen pemutih kulit.

Melanin is a natural complex pigment that responsible for the dark tone of skin. The standard of beauty in some countries including the countries in Africa, Asia, and Caribbean Island are having a bright skin. As the result, the demands of beauty products such as cosmetics and skincare products that contains whitening agents is increase. Beside its profit, the enhancements also bring a new worst case notably about the agents that contain harmful compounds for skin so that the development of experiments to discover a new natural compound as whitening agent are happened. Inventing enzymatically degrading melanin compounds using fungi is one of the solutions to find the natural one. Ligninolytic enzymes are potential oxidative enzymes which is effectively produced by fungi, for instance white-rot fungi. The dominated enzymes of ligninolytic enzyme groups are laccase and manganese peroxidase. Both have an ability to degrade the group of phenolics, aromatic compounds, and lignin in a broad range. Melanin is a biopolymer non phenolic compound that has large molecules. The similarity of structures and compositions with lignin leads to the potentially degrading by ligninolytic enzymes so that the enzymes could be the potential one to degrade those pigment. In this study, we have produced partially purified laccase-manganese peroxidase from a wild type of white-rot fungus called Trametes hirsuta LBF-AA017. The great activity to degrade the biomass, powder sorghum stem 4183 A, in the previous studies makes the enzymes suspected to be potentially used as whitening agent. Moreover, the detected ability of laccase dan manganese peroxidase purified of T. hirsuta LBF-AA017 to degrade melanin is the aim of this study. The produced enzymes of this study were successfully partially purified by several steps, comprises 80% ammonium sulphate precipitation, dialysis, ultrafiltration, and anion exchange chromatography with its column, Q Sepharose Fast Flow (QFF), using AKTAprime plus. The result of those procedures produced laccases with a 16-fold increase in specific activity (74,4 U/mg) that has 6,8% final yield. In addition, purified manganese peroxidase also has a 14-fold increase specific activity (7,3 U/mg) with 6,8% as final yield. Characterization of each enzymes have been done. The estimated molecular weight of the purified enzymes, laccase and manganese peroxidase were 60-70 kDa and 50-60 kDa. Both showed the activities in zymogram assay. Furthermore, the combination of both enzyme mediator, TEMPO-MnSO4-H2O2, and the highest concentration of both, laccase 22,5 U dan MnP 9 U, have been proved could degrade melanin effectively. Also, the mediator and enzyme concentration treatment delivered the alteration of O-H or N-H stretching melanin structure and its morphology was confirmed using FTIR-UATR and FE-SEM, respectively. Based on the ability, these enzymes could be a candidate of skin whitening agent.