Analisis Infektivitas Simian-Human Immunodeficiency Virus (SHIV) pada Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) Macaca fascicularis dan M. nemestrina Secara In Vitro

Abstract

Keterbatasan utama dalam upaya pengembangan vaksin dan pengobatan anti-retroviral terhadap infeksi human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) antara lain adalah ketiadaan model hewan yang dapat menunjukkan semua gejala menonjol infeksi HIV-1 seperti pada manusia. SHIV dikonstruksi untuk mengatasi keterbatasan model SIVmac dan telah dimanfaatkan pada banyak penelitian menggunakan satwa primata untuk mempelajari virus yang memiliki kedekatan dengan HIV-1 pada manusia. Satwa primata Macaca fascicularis dan M. nemestrina digunakan sebagai hewan coba penelitian HIV/AIDS dengan memanfaatkan virus kimera SHIV yang dihasilkan melalui penggantian susunan nukleotida bagian cyclophilin A binding region, gen viral infectivity factor (vif) dan gen negative factor (nef) HIV-1 dengan bagian cyclophilin A binding region, gen vif dan gen nef Simian Immunodeficiency Virus (SIV). Penelitian bertujuan untuk mengkaji model HIV/AIDS pada PBMC satwa primata secara in vitro menggunakan SHIV. Secara khusus, penelitian ini bertujuan untuk menganalisis kemampuan atau daya replikasi SHIV pada kultur sel PBMC asal M. fascicularis dan M. nemestrina secara in vitro. Penelitian dilakukan secara in vitro dengan menggunakan PBMC M. fascicularis dan M. nemestrina. Karakteristik M. fascicularis dan M. nemestrina yang digunakan dalam penelitian ini, yaitu jantan, dewasa dengan umur empat sampai enam tahun. SHIV merupakan hasil kontruksi Budiman Bela dan Silvia Triwidyaningtyas dari Pusat Riset Virologi dan Kanker Patobiologi (PRVKP) FKUI-RSCM. Isolasi PBMC dilakukan dengan metode densitas gradien sentrifugasi. Aktivasi PBMC dilakukan dengan menggunakan agen mitogenik, yaitu phytohaemagglutinin (PHA). PBMC terstimulasi PHA dihitung dengan hemositometer. PBMC terstimulasi PHA diinfeksi dengan supernatan sel transfektan yang mengandung SHIV dengan pengenceran 1:10. PBMC terstimulasi PHA juga diinfeksi dengan supernatan yang mengandung HIV dengan pengenceran 1:10 sebagai pembanding. Kultur PBMC terstimulasi PHA dilakukan selama 21 hari. Pemeliharaan kultur PBMC terstimulasi PHA dilakukan dengan pemberian nutrisi setiap minggu sekali. Supernatan PBMC terstimulasi PHA dikoleksi setiap hari. Pengamatan cytopathic effect (CPE) dilakukan menggunakan mikroskop cahaya. Konfirmasi CPE dilakukan dengan pemeriksaan imunofluoresen terhadap protein p24. Analisis CPE dilakukan secara kualitatif deskriptif dan ekspresi protein p24 dianalisis secara semi kuantitatif. Penggantian cyclophilin A binding region, gen vif dan gen nef HIV-1 dengan cyclophilin A binding region, gen vif dan gen nef SIV dapat meningkatkan kemampuan SHIV dalam menginfeksi PBMC M. fascicularis dan M. nemestrina. Infeksi SHIV pada kultur PBMC terstimulasi PHA M. fascicularis dan M. nemestrina ditandai dengan pembentukan CPE berupa multinucleated giant cell (MGCs). CPE pada kultur PBMC terstimulasi PHA M. fascicularis dan M. nemestrina mengekspresikan protein p24 dengan nilai masing-masing + (<10% sel terwarnai) dan ++ (10%-50% sel terwarnai). Penggantian susunan nukleotida cyclophilin A binding region meningkatkan pengikatan cyclophilin A (CypA) dengan gag SIV. Gen vif berperan sebagai pertahanan balik terhadap apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic subunit 3G (APOBEC3G) yang dapat menghambat replikasi retrovirus. Gen nef berperan dalam perkembangan AIDS dan antagonis terhadap tetherin. CPE dan ekspresi protein p24 pada kultur PHA-stimulated PBMC M. nemestrina lebih banyak dibandingkan pada kultur PHA-stimulated PBMC M. fascicularis. Perbedaan ini disebabkan adanya protein tripartite motif containing 5 (TRIM5) yang dapat membatasi replikasi virus. M. nemestrina mengekspresikan protein TRIMCyp yang tidak membatasi replikasi virus. Sementara itu, M. fascicularis mengekspresikan TRIM5α dan TRIMCyp yang dapat membatasi replikasi HIV-1 atau HIV-2. M. nemestrina memberikan hasil yang lebih baik sebagai model HIV/AIDS berbasis SHIV secara in vitro.

Development of HIV-1 vaccines and anti-retroviral treatment is currently hindered by the lack of models representing prominent symptoms of HIV-1 infections seen in humans. SHIV was constructed to resolve the limitations of SIVmac model and has been used in nonhuman primate model ofviral infections, particularly infections by the close relatives of HIV-1. Macaca fascicularis and M. nemestrina are being developed as model HIV/AIDS, by using chimeric virus SHIV produced by replacing the nucleotide structure of cyclophilin A binding region, vif gene and nef of HIV-1 with cyclophilin A binding region, vif gene and nef from SIV. The research aims to study the model of HIV/AIDS on nonhuman primates PBMC in vitro using SHIV. In particular, the study aims to analyze the capability of SHIV replication in PBMC of M. fascicularis and M. nemestrina. The research was conducted in vitro using PBMC M. fascicularis and M. nemestrina. M. fascicularis and M. nemestrina used in this study were adult males of four to six years aged. SHIV is construction by Budiman Bela and Silvia Triwidyaningtyas from Institute of Human Virology and Cancer Biology (IHVCB), Faculty of Medicine, University of Indonesia. PBMC isolation using density gradient centrifugation method. Activation of PBMC using mytogenic agent, PHA. PHA-stimulated PBMC calculated using hemocytometer. PHA-stimulated PBMC infected with a supernatant from transfective cells containing SHIV with 1:10 dilution. PHA-stimulated PBMC infected with a supernatant containing HIV with 1:10 dilution as a comparison. PHA-stimulated PBMC culture carried out for 21 days. PHA-stimulated PBMC culture maintenance by re-feeding every week. Supernatant of PHA-stimulated PBMC collected daily. CPE observations using light microscope. CPE confirmation using immunofluorescent examination of p24 protein. CPE analysis conducted qualitative descriptive and p24 proteins expression analysis conducted semi quantitative. Replacement of cyclophilin A binding region, vif gene and nef genes HIV-1 with of cyclophilin A binding region, vif gene and nef genes SIV increasing SHIV ability to infect PBMC M. fascicularis and M. nemestrina. SHIV infection in PHA-stimulated PBMC cultures M. fascicularis and M. nemestrina characterized by the formation of CPE, MGCs. CPE in PHA-stimulated PBMC cultures M. fascicularis and M. nemestrina expresses p24 protein with their respective values + (<10% colored cells) and ++ (10%-50% colored cells). Replacement of nucleotide of cyclophilin A binding region improving CypA bind with gag SIV. Vif gene is APOBEC3G antagonist which can inhibit retrovirus replication. Nef gene play role for AIDS development and tetherin antagonist. CPE and p24 protein expression in PHA-stimulated PBMC culture M. nemestrina more than in PHA-stimulated PBMC culture M. fascicularis. This difference is due to the presence of TRIM5 proteins that inhibit viral replication. M. nemestrina expresses TRIMCyp proteins that do not limit viral replication. Meanwhile, M. fascicularis expresses TRIM5α and TRIMCyp which can limit replication of HIV-1 or HIV-2. M. nemestrina provides better results as a HIV/AIDS model based SHIV in vitro.