Peningkatan Akumulasi Tiamin pada Kultur Escherichia coli melalui Peningkatan Oksigenasi dan Penghilangan rpoS

Abstract

Thiamine is one of the essential compounds for microorganisms in the metabolic process of their growth. Thiamine plays a role as a precursor in the pathway for thiamine diphosphate formation. Thiamine diphosphate is a coenzyme for essential enzymes involved in the metabolic pathway of Escherichia coli. Escherichia coli can synthesize thiamine by de novo. Several things that affect the synthesis of thiamine in Escherichia coli such as nutritional deficiencies, oxidative stress cause of exposure to ROS (Reactive Oxygen Species) and the process of respiration in cells to produce ATP. In stress environmental conditions, thiamine plays a protective role in maintaining metabolic processes. In addition, Escherichia coli also has the global regulator rpoS which controls regulatory and structural genes when cells are under stress conditions, including oxidative stress. Enhancing accumulation of thiamine in Escherichia coli cells can be accomplished through inducing oxygenation and deleting global regulator rpoS. The first stage in this study was investigated the effect of inducing oxygenation on thiamine accumulation in Escherichia coli BW25113 culture (parent strain) by giving rotation speed variation treatment in 150 rpm and 200 rpm shaking culture as physical oxidative stress cultivated on Luria Bertani (LB) media enriched high glucose concentration (40 g/L) for 24 hours at 37℃ . A further enhancing thiamine accumulation, confirmed by cultivation of Escherichia coli BW25113-∆rpoS (rpoS mutant) compared to the parent strain at high rotation speed at shaking culture (200 rpm). The parameters investigated were the concentration of thiamine formed and the direction of carbon central metabolism were analyzed based on dry cell weight, substrate consumption, and acetate formation. The results showed that inducing oxygenation at rotation speed at shaking culture from 150 rpm to 200 rpm could enhance thiamine accumulation in Escherichia coli BW25113 culture (parent strain) from 11.87 g/g DCW to 16.81 g/g DCW. Enhancing accumulation of thiamine is affected by oxidative stress physically provided in this case oxygen can induce thiamine synthesis and it is thought an indication of the protective role of thiamine to maintain its metabolism. However, under these conditions there is competition with the presence of rpoS which controls various types of stress conditions and active under oxidative stress. The presence of rpoS at conditions of high oxygen and high glucose causes the direction of cell metabolism tend to formation pathway of by-products, namely acetate. Thus, further confirmation of enhancing thiamine through the deleting of rpoS. The results showed that there was an enhancing thiamine accumulation in rpoS mutant compared to the parent strain by 9.5%. This can be occured because rpoS has a negative regulation of purine metabolism and the thiI gene which is a metabolic pathway and a gene that contributes to the thiamine formation pathway.

Tiamin merupakan salah satu senyawa esensial bagi mikroorganisme dalam proses metabolisme pertumbuhannya. Tiamin berperan sebagai prekursor pada jalur pembentukan tiamin difosfat. Tiamin difosfat merupakan koenzim bagi enzim-enzim esensial yang terlibat pada jalur metabolisme Escherichia coli. Escherichia coli dapat mensintesis tiamin secara de novo. Beberapa hal yang mempengaruhi sintesis tiamin pada Escherichia coli di antaranya kekurangan nutrisi, stres oksidatif akibat dari paparan ROS (Reactive Oxygen Species) serta proses respirasi pada sel untuk menghasilkan ATP. Pada kondisi lingkungan stres, tiamin berperan sebagai protektif dalam mempertahankan proses metabolismenya. Selain itu, Escherichia coli juga memiliki global regulator rpoS yang mengontrol gen regulator dan gen struktural ketika sel berada dalam kondisi stres, termasuk stres oksidatif. Peningkatan akumulasi tiamin pada sel Escherichia coli dapat dilakukan melalui peningkatan oksigenasi dan penghilangan global regulator rpoS. Tahap awal pada penelitian ini, pengamatan pengaruh peningkatan oksigenasi terhadap akumulasi tiamin pada kultur Escherichia coli BW25113 (galur induk) dengan pemberian perlakuan variasi kecepatan rotasi pada kultur bergoyang 150 rpm dan 200 rpm sebagai stres oksidatif fisik yang dikultivasi pada media Luria Bertani (LB) diperkaya glukosa tinggi (40 g/L) selama 24 jam pada suhu 37 ℃. Peningkatan akumulasi tiamin lebih lanjut, dikonfirmasi melalui kultivasi Escherichia coli BW25113-∆rpoS (mutan rpoS) dibandingkan dengan galur induk pada kecepatan rotasi kultur bergoyang yang tinggi (200 rpm). Parameter yang diamati yaitu konsentrasi tiamin yang terbentuk dan arah metabolisme sentral karbon dianalisis berdasarkan bobot sel kering, konsumsi substrat dan pembentukan asetat. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa peningkatan oksigenasi pada kecepatan rotasi kultur bergoyang dari 150 ke 200 rpm dapat meningkatkan akumulasi tiamin pada kultur Escherichia coli BW25113 (galur induk) yaitu dari 11.87 g/g DCW menjadi 16.81 g/g DCW. Peningkatan akumulasi tiamin dipengaruhi oleh stres oksidatif secara fisik yang diberikan dalam hal ini oksigen dapat menginduksi sintesis tiamin. Hal ini diduga sebagai indikasi peran protektif tiamin untuk mempertahankan metabolismenya. Namun, pada kondisi tersebut terjadi persaingan dengan keberadaan rpoS yang mengontrol berbagai jenis kondisi stres dan aktif pada kondisi stres oksidatif. Keberadaan rpoS pada kondisi oksigen tinggi dan glukosa tinggi menyebabkan arah metabolisme sel cenderung ke jalur pembentukan produk samping yaitu asetat. Dengan demikian, dilakukan konfirmasi lebih lanjut peningkatan tiamin melalui penghilangan rpoS. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa terjadi peningkatan akumulasi tiamin pada mutan rpoS dibandingkan dengan sel induk sebesar 9.5%. Hal ini dapat terjadi karena rpoS memiliki regulasi negatif terhadap metabolisme purin dan gen thiI yang merupakan jalur metabolisme dan gen yang berkontribusi pada jalur pembentukan tiamin.