Ekspresi Gen B11 dari Padi Varietas Hawara Bunar dalam Sistem Escherichia coli.

Abstract

Gen B11 adalah gen toleransi aluminium (Al) yang diisolasi dari padi lokal Indonesia var. Hawara Bunar menggunakan teknik polymerase chain reaction (PCR). Gen B11 dapat dimanfaatkan untuk peningkatan ketahanan tanaman melalui pendekatan rekayasa genetik. Namun, protein B11 perlu dikarakterisasi terlebih dahulu untuk mengetahui fungsi dari protein tersebut dalam mekanisme toleransi padi terhadap cekaman Al. Tujuan dari penelitian ini adalah mengekspresikan gen B11 pada sistem Escherichia coli untuk memproduksi protein rekombinan B11 dan mengkarakterisasi protein tersebut. Fragmen cDNA B11 berukuran 573bp diligasikan ke dalam vektor kloning pGEMT-Easy (pGEMT-B11). Plasmid tersebut ditransformasikan ke dalam E. coli DH5α dan dikultivasi pada media seleksi LB yang ditambahkan antibiotik. Plasmid rekombinan pGEMT-B11 dipurifikasi dan diamplifikasi dengan primer B11 dengan penambahan adaptor site enzim restriksi NdeI dan BamHI masing-masing pada ujung 3’ dari primer forward and reverse. Fragmen B11NB hasil amplifikasi dengan PCR kemudian dipurifikasi dan diligasikan ke dalam vektor ekspresi pET-15b yang telah dipotong dengan enzim restriksi NdeI dan BamHI untuk menghasilkan plasmid rekombinan pET-B11. Transformasi vektor pET-B11 dilakukan pada E. coli BL21(DE3)pLysS. Ekspresi gen B11 dalam rekombinan E. coli BL21(DE3)pLysS diinduksi dengan menggunakan IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside). Protein rekombinan B11 dipurifikasi dengan QIAGEN Ni-NTA Spin Kit (Qiagen, DE). Profil protein divisualisasi pada SDS-PAGE (12%) dengan pewarnaan Comassive Blue. Ekspresi gen B11 dengan qRT-PCR meliputi tiga tahapan, yaitu: isolasi RNA total, sintesis cDNA, dan analisis ekspresi gen dengan qRT-PCR. Gen B11 telah berhasil dikloning ulang pada bakteri E. coli DH5α. Selain itu, gen B11 telah berhasil disubkloning pada E. coli BL21(DE3)pLysS dengan bantuan vector pET-15b, sehingga dapat diekspresikan. Open reading frame gen B11 terdiri dari 342 bp dan menyandikan 113 asam amino dengan bobot molekul sebesar 11.61 kDa. Protein B11 mengandung motif protein ribosomal L32p pada asam amino ke 58 sampai asam amino 102. Struktur 3D protein B11 berhasil dimodelkan dan divalidasi. Bagian protein B11 pengkelat logam terdeteksi pada asam amino GLY23, GLY106, dan ASP110. Ekspresi gen B11 pada E. coli rekombinan pada kondisi induksi IPTG 5.4 kali kali lebih tinggi dibandingkan ekspresi pada E. coli rekombinan tanpa induksi IPTG.