Ekspresi Gen B11 dari Padi Varietas Hawara Bunar dalam Sistem Escherichia coli.
View/ Open
Date
2020Author
Umaiyah, Eka Indah
Miftahudin
Wahyudi, Aris Tri
Artika, I Made
Metadata
Show full item recordAbstract
Gen B11 adalah gen toleransi aluminium (Al) yang diisolasi dari padi lokal
Indonesia var. Hawara Bunar menggunakan teknik polymerase chain reaction
(PCR). Gen B11 dapat dimanfaatkan untuk peningkatan ketahanan tanaman melalui
pendekatan rekayasa genetik. Namun, protein B11 perlu dikarakterisasi terlebih
dahulu untuk mengetahui fungsi dari protein tersebut dalam mekanisme toleransi
padi terhadap cekaman Al. Tujuan dari penelitian ini adalah mengekspresikan gen
B11 pada sistem Escherichia coli untuk memproduksi protein rekombinan B11 dan
mengkarakterisasi protein tersebut. Fragmen cDNA B11 berukuran 573bp
diligasikan ke dalam vektor kloning pGEMT-Easy (pGEMT-B11). Plasmid
tersebut ditransformasikan ke dalam E. coli DH5α dan dikultivasi pada media
seleksi LB yang ditambahkan antibiotik.
Plasmid rekombinan pGEMT-B11 dipurifikasi dan diamplifikasi dengan
primer B11 dengan penambahan adaptor site enzim restriksi NdeI dan BamHI
masing-masing pada ujung 3’ dari primer forward and reverse. Fragmen B11NB
hasil amplifikasi dengan PCR kemudian dipurifikasi dan diligasikan ke dalam
vektor ekspresi pET-15b yang telah dipotong dengan enzim restriksi NdeI dan
BamHI untuk menghasilkan plasmid rekombinan pET-B11. Transformasi vektor
pET-B11 dilakukan pada E. coli BL21(DE3)pLysS. Ekspresi gen B11 dalam
rekombinan E. coli BL21(DE3)pLysS diinduksi dengan menggunakan IPTG
(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside). Protein rekombinan B11 dipurifikasi
dengan QIAGEN Ni-NTA Spin Kit (Qiagen, DE). Profil protein divisualisasi pada
SDS-PAGE (12%) dengan pewarnaan Comassive Blue. Ekspresi gen B11 dengan
qRT-PCR meliputi tiga tahapan, yaitu: isolasi RNA total, sintesis cDNA, dan
analisis ekspresi gen dengan qRT-PCR.
Gen B11 telah berhasil dikloning ulang pada bakteri E. coli DH5α. Selain itu,
gen B11 telah berhasil disubkloning pada E. coli BL21(DE3)pLysS dengan bantuan
vector pET-15b, sehingga dapat diekspresikan. Open reading frame gen B11 terdiri
dari 342 bp dan menyandikan 113 asam amino dengan bobot molekul sebesar 11.61
kDa. Protein B11 mengandung motif protein ribosomal L32p pada asam amino ke
58 sampai asam amino 102. Struktur 3D protein B11 berhasil dimodelkan dan
divalidasi. Bagian protein B11 pengkelat logam terdeteksi pada asam amino
GLY23, GLY106, dan ASP110. Ekspresi gen B11 pada E. coli rekombinan pada
kondisi induksi IPTG 5.4 kali kali lebih tinggi dibandingkan ekspresi pada E. coli
rekombinan tanpa induksi IPTG.