Potensi Conditioned Medium Sel Testikuler dalam Mendukung Spermatogenesis In Vitro pada Mencit: Sebuah Prospek untuk Mengatasi Masalah Infertilitas pada Jantan
View/ Open
Date
2020Author
Prasetyaningtyas, Wahono Esthi
Agungpriyono, Srihadi
Fahrudin, Mokhamad
Karja, Ni Wayan Kurniani
Metadata
Show full item recordAbstract
Primordial Germ Cells (PGC) merupakan sel prekursor sel gamet jantan
maupun betina. Sel ini berasal dari lapis epiblast kemudian bermigrasi melewati
mesenterium menuju rigi kelamin. Pada umur 13.5 hari pascakoitus (hpk) sel ini
berada di rigi kelamin dan sudah mengalami determinasi jenis kelamin. Primordial
Germ Cells (PGC) bersifat totipoten dengan gen penanda OCT-4, sehingga PGC
diharapkan dapat digunakan dalam terapi penyakit degenaratif ataupun pada kasus
infertilitas. Penelitian ini betujuan untuk profiling protein di dalam conditioned
medium (CM) dari sel testikuler mencit umur 5 hari, mengkarakterisasi PGC dan
menganalisis kemampuan CM dalam menginduksi PGC menjadi sel gamet jantan
yang haploid.
Penelitian tahap pertama bertujuan untuk mengkarakterisasi perkembangan
sel testikuler dan mengidentifikasi spermatogonial stem cells (SSC) dalam kultur
in vitro. Sel testiskuler dari mencit umur 5 hari di kultur dalam Dulbecco’s
Modified Eagle Medium (DMEM) yang ditambahkan serum 10%, kemudian
diinkubasi pada suhu 37 °C, 5% CO2. Perkembangan sel diamati selama 6 hari yang
meliputi viabilitas dan population doubling time (PDT). Sel kultur hari ke-1, ke-3
dan ke-6 diwarnai dengan pewarna Periodic Acid Schiff (PAS) untuk
mengidentifikasi dan mengukur luas sel testikuler. Secara spesifik, identifikasi SSC
menggunakan pewarnaan imunositokimia menggunakan antibodi OCT-4 dan
CD90. Hasil penelitian menunjukkan PDT sel testikuler sebesar 0.63 hari dan
viabilitas >90%. Persentase sel Sertoli-like meningkat selama kultur, begitu juga
dengan sel fibroblast-like yang meningkat pada hari ke-3 dan menurun pada hari
ke-6 walaupun tidak signifikan. Sementara itu, sel spermatogonia-like menurun
dari hari ke-1 sebesar 54.3%, menjadi 18.7% pada hari ke-6. Luas sel testikuler
meningkat signifikan setelah kultur selama 6 hari. Sel testikuler dan SSC di dalam
kultur diduga menghasilkan growth factors di dalam niche. Pada akhir kultur (hari
ke-6), medium kultur diganti dengan DMEM tanpa serum dengan tujuan sebagai
sumber conditioned medium (CM).
Penelitian tahap kedua dilaksanakan untuk menganalisis kandungan protein
(profiling) serta kandungan hormon testosteron dalam conditioned medium yang
diperoleh dari kultur sel testikuler. Profiling protein menggunakan liquid
chromatography-mass spectrometry (LC-MS/MS), dan ditemukan 26 jenis protein
yang berperan sebagai struktur sel dan proses seluler. Protein yang paling banyak
diidentifikasi dalam CM adalah kolagen, yang terdiri atas beberapa jenis, yaitu:
Collagen alpha-1(I) chain (Col1a1), Collagen alpha-2(I) chain (Col1a2), Collagen
alpha-1(III) chain (Col3a1), Collagen alpha-1(IV) chain (Col4a1) dan Collagen
alpha-2(V) chain (Col5a2). Kolagen berperan sebagai matrix extracellular (ECM)
dan akan berinteraksi dengan reseptor. Konsentrasi testosteron di dalam CM adalah
0.542 ng/mL. Kandungan CM sel testikuler diharapkan mendukung proses
perkembangan sel germinal.
Penelitian tahap ketiga adalah karakterisasi fetus sumber rigi kelamin, serta
karakterisasi rigi kelamin sebagai sumber PGC baik secara makroskopis maupun
mikroskopis, serta perbanyakan PGC. Penelitian tahap ini menggunakan fetus
mencit umur 13.5 hpk sebagai sumber rigi kelamin. Fetus diukur dan ditimbang,
rigi kelamin diisolasi untuk preparat histologi dan dikultur. Rigi kelamin diwarnai
dengan Hematoksilin Eosin (HE) dan pewarnaan immunositokimia menggunakan
antibodi VASA sebagai penanda PGC. Perbanyakan PGC dilakukan dengan kultur
in vitro selama 9 hari, medium yang digunakan adalah DMEM+Serum 15% dan
DMEM+Serum 15% dengan perlakuan penambahan leukemia inhibitory
factor (LIF) 1000 IU/mL. Sel kultur diwarnai pada hari ke-3, ke-6 dan ke-9 kultur
dengan pewarnaan immunositokimia menggunakan antibodi OCT-4. Hasil
penelitian menunjukkan bahwa fetus umur 13.5 hpk dengan ukuran berkisar 11 mm,
memiliki rigi kelamin yang secara morfologi bisa dibedakan antara jantan dan
betina. Karakteristik rigi kelamin secara mikroskopis terlihat bahwa PGC terdapat
di tengah tali testis yang dikelilingi oleh sel Sertoli. Proliferasi PGC relatif lambat
dengan nilai PDT 1.3 hari dengan viabilitas sekitar 85%. Kultur PGC dengan
perlakuan DMEM + Serum 15%, menunjukkan penurunan persentase PGC yang
mengekspresikan OCT-4 mulai hari ke-3 sedangkan pada perlakuan DMEM +
Serum 15% + LIF 1000 IU/mL terjadi peningkatan persentase PGC yang
mengekspresikan OCT-4 pada hari ke-6 tetapi turun kembali pada hari ke-9.
Penambahan LIF mampu mempertahankan jumlah PGC sampai hari ke-6 kultur.
Penelitian tahap keempat adalah mengetahui arah diferensiasi PGC yang
diinduksi dengan menggunakan CM sel testikuler. PGC yang telah diisolasi
dikultur selama satu minggu untuk memperbanyak PGC dalam kultur dengan
penambahan LIF, selanjutnya ditambahkan CM sebesar 40% dan 60% kemudian
dikultur selama 3 minggu. Ekspresi gen PGC hasil kultur dianalisis dengan
menggunakan Real Time-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) dan medium
kultur dianalisis kandungan testosteronnya menggunakan enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA). Hasil penelitian menunjukkan bahwa sel rigi
kelamin yang dikultur selama 14 hari menunjukkan sel yang membentuk koloni
yang mirip tali testis. Struktur spermatid-like terlihat pada hari ke-18 kultur dan
spermatozoa-like pada hari ke-24 kultur. Ekspresi gen penanda sel germinal, pada
kelompok 60% ditemukan ekspresi gen OCT-4 dan ACR mengalami downregulated,
sedangkan ekspresi gen DAZL, VASA, STRA 8 dan PRM 1 mengalami
up-regulated. Sementara itu, pada kelompok 40% menunjukkan bahwa semua gen
yang dianalisis terekspresi secara down-regulated. Hormon testosteron yang diukur
dari medium kultur menunjukkan penurunan konsentrasi pada minggu ke-2 dan
naik kembali pada minggu ke-3 dengan konsentrasi tertinggi pada kelompok
kontrol, yang diikuti oleh kelompok CM 60% dan CM 40%. Penambahan CM 60%
mampu menginduksi PGC mengalami spermatogenesis in vitro.
Collections
- DT - Veterinary Science [285]