| dc.description.abstract | Udang adalah produk perikanan andalan Indonesia yang menjadi komoditas
ekspor, salah satu jenis paling dominan untuk diekspor adalah udang vaname
(Litopenaeus vannamei). Tahun 2009 di negara Cina, budidaya udang vaname
menghadapi kendala dengan munculnya kasus kematian dini yang menyerang
udang sekitar hari ke-30 setelah penebaran pada kolam pemeliharaan yang ditandai
dengan kerusakan pada hepatopankreas (nekrosis hepatopankreatik akut). Awalnya
penyakit ini disebut sindrom kematian dini (EMS/ Early mortality syndrome), tetapi
setelah ditemukannya Vibrio parahaemolyticus strain unik penyebab penyakit ini,
nama penyakit dirubah menjadi nekrosis hepatopankreatik akut atau disebut dengan
AHPND (Acute hepatopancreatic necrosis disease). Oleh karena itu, Vibrio
parahaemolyticus penyebab penyakit AHPND pada udang vaname disebut V.
parahaemolyticus strain AHPND. V. parahaemolyticus strain AHPND pada udang
vaname memiliki kelompok gen tdh dan trh yang dapat menghasilkan toksin pir
A/B penyebab kerusakan pada hepatopankreas dan mengakibatkan kematian pada
udang. Pada awal penggunaan metoda biomolekular untuk mendeteksi AHPND
hanya dengan PCR konvensional yaitu dengan pasangan primer AP1 dan AP2,
kemudian pasangan primer AP3. Tahun 2015 muncul terobosan mendesain
pasangan primer VpPirA real time PCR untuk mendeteksi AHPND dan
membandingkannya dengan pasangan primer AP3 single step pada PCR
konvensional, hasilnya adalah pasangan primer VpPirA real time PCR lebih
sensitif, spesifik dan efisien dari pasangan primer AP3 single step PCR
konvensional. Tahun 2015 juga muncul pasangan primer AP4 nested PCR
konvensional untuk mendeteksi AHPND yang lebih baik dari pasangan primer AP3
single step. Oleh karena itu, perlu dilakukan penelitian untuk menguji validitas
metoda real time PCR pasangan primer VpPirA.
Penelitian dilaksanakan pada bulan Januari sampai dengan Mei 2019, di
Laboratorium Balai Uji Standar Karantina Ikan, Pengendalian Mutu dan Keamanan
Hasil Perikanan (BUSKIPM), Jakarta. Pelaksanaan penelitian ini terbagi ke dalam
dua tahapan, yaitu validasi metoda uji dan uji performa metoda. Validasi metoda
uji terdiri dari beberapa tahap, yaitu pembuatan kontrol positif dan kurva standar,
dilanjutkan dengan uji spesifisitas dan uji sensitivitas, kemudian uji repeatability
(keterulangan) dan reproducibility (ketertiruan). Uji spesifisitas dilakukan dengan
menentukan selektifitas dan eksklusifitas metoda uji real time PCR pasangan
primer VpPirA, sedangkan untuk uji sensitivitas metoda uji real time PCR
pasangan primer VpPirA dilakukan dengan menentukan limit deteksi (LoD) dan
nilai cut off. Uji keterulangan dan ketertiruan dilakukan berdasarkan antar analis
dan waktu pengujian metoda uji real time PCR pasangan primer VpPirA. Uji
performa metoda dilakukan dengan pengujian lapang dengan pengambilan sampel
pada beberapa sentra budidaya udang vaname di Indonesia. Data yang diperoleh
merupakan data deskriptif dengan melihat persentase koefisien varians (CV%).
Pengujian validitas dalam mendeteksi gen penyandi toksin pirA dengan
menggunakan metoda real time PCR diawali pembuatan kontrol positif berupa
plasmid DNA V. parahaemolyticus strain AHPND dengan konsentrasi 6 x 109 kopi
μL-1, sedangkan hasil pembentukan kurva standar metoda qPCR pasangan primer
VpPirA mempunyai efisiensi pengujian sebesar 99.857% dan kemiringan antar Ct
adalah -3.472. Hasil pengujian spesifisitas menunjukkan bahwa metoda qPCR
pasangan primer PirA bersifat selektif dan eksklusif, karena tidak bereaksi terhadap
matriks sampel yang berupa DNA atau RNA udang dan tidak bereaksi silang (cross
reactive) terhadap berbagai spesies bakteri dan penyakit udang lain yang tidak
mengandung gen penyandi toksin pirA. Performa sensitivitas analitik metoda qPCR
pasangan primer PirA menunjukkan bahwa qPCR pasangan primer PirA mampu
mendeteksi konsentrasi DNA yang lebih rendah dibandingkan dengan PCR
konvensional pasangan primer AP4. Nilai cut off qPCR adalah Ct 39, sehingga
untuk hasil pengujian dengan nilai Ct < 39 dinyatakan positif, sedangkan nilai Ct >
39 dinyatakan negatif, dan apabila nilai Ct = 39 maka pengujian harus diulang.
Metoda qPCR pasangan primer PirA menunjukkan hasil repitabilitas dan
reprodusibilitas yang baik, sesuai dengan nilai maksimal repitabilitas (intra assay)
adalah 5% dan reprodusibilitas (inter assay) adalah 10%. Penilaian hasil uji lapang
berupa perhitungan sensitivitas diagnostik (DSe) dan spesifisitas diagnostik (DSp)
menunjukkan performa diagnostik yang sangat baik diatas 95%, sehingga metoda
real time PCR hidrolisis probe sangat sensitif dan spesifik dalam mendeteksi gen
penyandi toksin pirA pada udang vaname.
Hasil penelitian menyimpulkan bahwa metoda real time PCR hidrolisis probe
pasangan primer PirA telah divalidasi dan dapat digunakan sebagai metoda uji
dalam mendeteksi dan mendiagnosa keberadaan gen penyandi toksin pirA pada
udang vaname (Litopenaeus vannamei). Hasil deteksi V. parahaemolyticus strain
AHPND terhadap seluruh sampel yang berasal dari tambak-tambak udang vaname
mendapatkan hasil negatif. Metoda real time PCR hidrolisis probe perlu
dikembangkan untuk dapat mendeteksi dan mendiagnosa keberadaan gen penyandi
toksin pirB pada udang vaname, mengingat toksin yang dihasilkan oleh patogen V.
parahaemolyticus strain AHPND adalah gen penyandi toksin pirA dan pirB. | id |
