Pengembangan Marka SNP Berbasis Gen Faktor Transkripsi untuk Toleransi Kekeringan atau Salinitas pada Tanaman Hotong [Setaria italica (L.) Beauv].

Abstract

Hotong [Setaria italica (L.) BEAUV] merupakan tanaman serealia dengan kandungan protein yang tinggi dan kaya akan manfaat kesehatan pada bijinya. Tanaman ini memiliki tingkat toleransi terhadap cekaman kekeringan atau salinitas yang relatif lebih baik dibandingkan dengan tanaman serealia lainnya, sehingga berpotensi untuk dikembangkan sebagai tanaman pangan alternatif dan fungsional pada lahan-lahan sub-optimal. Keragaman dalam tingkat toleransi kekeringan atau salinitas dijumpai pada genotipe hotong. Perbaikan sifat diperlukan untuk meningkatkan tingkat toleransi genotipe hotong yang peka terhadap kekeringan atau salinitas. Salah satu usaha yang dapat ditempuh untuk meningkatkan toleransi hotong terhadap kekeringan atau salinitas adalah melalui pemanfaatan marka DNA berbasis Single Nucleotide Polymorphism (SNP). Pemilihan kandidat gen merupakan hal yang terpenting dalam pengembangan marka berbasis SNP. Gen faktor transkripsi merupakan kelas gen yang berfungsi sebagai regulator terhadap ekspresi gen-gen lain yang terlibat secara dalam mekanisme adaptasi tanaman terhadap cekaman kekeringan atau salinitas. DREB2 (Dehydration Responsive Element Binding 2) dan NAC (NAM, ATAF, dan CUC) merupakan dua gen faktor transkripsi yang terregulasi pada saat tanaman berada pada kondisi tercekam kekeringan atau salinitas. Kedua gen tersebut berpotensi untuk digunakan sebagai dasar pengembangan marka molekuler berbasis SNP. Deteksi SNP dapat dilakukan melalu berbagai macam teknik. Analisis dotblot SNP dan marka Single Nucleotide Amplified Polymorphism (SNAP) merupakan dua teknik deteksi SNP yang sederhana dan berpotensi untuk diaplikasikan dalam pemuliaan hotong. Tujuan dari penelitian ini adalah mengembangkan marka SNP berbasis gen faktor transkripsi untuk toleransi kekeringan atau salinitas pada tanaman hotong. SNP akan dideteksi menggunakan analisis dot-blot SNP dan marka SNAP. Kondisi optimum dari setiap teknik akan diaplikasikan untuk mendeteksi 26 genotipe hotong hasil eksplorasi yang belum diketahui tingkat toleransinya terhadap cekaman kekeringan atau salinitas. Penelitian terdiri atas tiga percobaan. Percobaan pertama adalah Karakterisasi dan Analisis Situs SNP pada Gen SiDREB2, SiNAC065, dan SiNAC110. Tujuan dari percobaan pertama adalah mendapatkan informasi mengenai karakteristik gen dan SNP pada ketiga gen faktor transkripsi dengan alel spesifik untuk toleransi kekeringan atau salinitas pada hotong. Materi yang digunakan adalah sekuen gen faktor transkripsi SiDREB2, SiNAC065, dan SiNAC110 dari empat genotipe hotong yang telah diketahui tingkat toleransinya terhadap cekaman kekeringan atau salinitas, yaitu ICERI-5, ICERI-6 (toleran), ICERI-4, dan ICERI-10 (peka). Hasil percobaan menunjukkan bahwa terdapat domain terkonservasi yang teridentifikasi pada ketiga sekuen asam amino faktor transkripsi dan terdapat satu SNP yang memiliki alel spesifik untuk toleransi kekeringan atau salinitas pada hotong. Genotipe toleran memiliki alel A, sedangkan genotipe peka memiliki alel G. SNP tersebut terletak pada nukleotida ke 558 pada gen SiDREB2 dan kemudian digunakan sebagai dasar pengembangan marka SNP. Percobaan kedua adalah Deteksi Alel SNP pada Gen SIDREB2 yang Spesifik Terhadap Toleransi Kekeringan atau Salinitas pada Hotong menggunakan Analisis Dot-blot SNP. Tujuan dari percobaan ini adalah menentukan kondisi optimum untuk mendeteksi SNP pada nukleotida ke 558 di gen SiDREB2 yang spesifik terhadap toleransi kekeringan atau salinitas pada hotong. Dua faktor yang mempengaruhi keberhasilan analisis dot-blot SNP untuk mendeteksi SNP secara spesifik dioptimasi dalam percobaan ini, yaitu temperatur hibridisasi dan rasio probe kompetitif. Empat kondisi hibridisasi yang terdiri atas kombinasi antara dua suhu hibridisasi (50 dan 55 ºC) dan dua rasio probe kompetitif (1:5 dan 1:10) dioptimasi. Kondisi hibridsasi kedua (suhu hibridisasi 50 ºC dan rasio probe kompetitif 1:10) memberikan hasil terbaik untuk mendeteksi SNP. Percobaan ketiga adalah Deteksi Alel SNP pada Gen SIDREB2 yang Spesifik Terhadap Toleransi Kekeringan atau Salinitas pada Hotong menggunakan Marka SNAP. Tujuan dari percobaan ini adalah mengembangkan dan mengoptimasi marka SNAP untuk mendeteksi SNP pada nukleotida ke 558 di gen SiDREB2 yang memiliki alel spesifik untuk toleransi kekeringan atau salinitas pada hotong. Tiga faktor yang mempengaruhi amplifikasi spesifik menggunakan marka SNAP dioptimasi dalam percobaan ini. Faktor tersebut adalah jenis DNA polimerase, banyaknya siklus PCR, dan konsentrasi DNA cetakan. Hasil percobaan menunjukkan bahwa jenis DNA polimerase merupakan faktor yang paling berpengaruh terhadap keberhasilan deteksi SNP menggunakan marka SNAP. DNA polimerase tanpa aktivitas proofreading merupakan jenis terbaik untuk mengamplifikasi marka SNAP. Kondisi optimum dari analisis dot-blot SNP dan marka SNAP diaplikasikan untuk mendeteksi SNP pada 26 genotipe hotong hasil eksplorasi yang belum diketahui tingkat toleransinya terhadap cekaman kekeringan atau salinitas. Deteksi SNP yang bersifat spesifik terhadap alel dapat dilakukan menggunakan kondisi optimum dari setiap teknik. Hasil deteksi SNP menggunakan analisis dot-blot SNP dan marka SNAP menunjukkan bahwa keduapuluh enam genotipe hotong memiliki alel G. Alel G merupakan alel spesifik untuk sifat peka terhadap cekaman kekeringan atau salinitas, sehingga keduapuluh enam genotipe hotong diprediksi peka terhadap cekaman kekeringan atau salinitas. Hasil prediksi tingkat toleransi hotong terhadap toleransi cekaman kekeringan atau salinitas akan bermanfaat dalam program pemuliaan hotong terhadap cekaman kekeringan atau salinitas.