Preservasi Jaringan Tanaman, Deteksi Dan Identifikasi Fitoplasma Pada Kacang Tanah Bergejala Sapu Dengan Teknik Nested-Pcr

Abstract

Fitoplasma adalah bakteri tanpa dinding sel yang menginfeksi jaringan floem tanaman. Penyakit sapu tanaman kacang tanah yang disebabkan oleh fitoplasma umum ditemukan di Indonesia. Deteksi fitoplasma pada tanaman masih cukup sulit dilakukan dengan pendekatan konvensional karena patogen ini bersifat obligat dan seringkali terdapat dalam konsentrasi yang sangat rendah. Teknik molekuler telah banyak digunakan dalam penelitian fitoplasma untuk mengatasi beberapa kendala ketika menggunakan metode konvensional. Polymerase chain reaction (PCR) adalah metode yang handal untuk mendeteksi fitoplasma pada tanaman inang. Namun berbagai faktor dapat mempengaruhi deteksi fitoplasma dengan metode PCR, termasuk penyediaan tanaman segar. Pengiriman contoh tanaman dalam waktu lama di perjalanan maupun penyimpanan yang tidak tepat di laboratorium dapat mengakibatkan munculnya senyawa-senyawa yang dapat menghambat amplifikasi DNA target. Penelitian ini bertujuan menentukan aspek lama, suhu, dan media penyimpanan yang optimal untuk jaringan tanaman kacang tanah terinfeksi fitoplasma, mengevaluasi amplifikasi DNA yang optimal dalam deteksi fitoplasma menggunakan nested- PCR, dan identifikasi fitoplasma berdasarkan analisis nukleotida gen 16S rRNA. Penyimpanan contoh tanaman kacang tanah bergejala sapu pada suhu dan media berbeda dalam periode waktu 4 minggu menunjukkan hasil yang bervariasi. Penyimpanan contoh selama 4 minggu pada suhu -20 ºC dan suhu 4 ºC hingga minggu ke-3 tidak mengalami perubahan bentuk dan sedikit terjadi perubahan warna contoh jaringan tanaman. Penyimpanan contoh pada suhu 25 ºC dalam bufer CTAB selama 4 minggu tidak mengalami perubahan bentuk maupun warna. Contoh yang tetap segar sebagai bahan untuk ekstraksi DNA total menggunakan metode CTAB menghasilkan DNA pada kualitas dan kuantitas DNA yang memadai berdasarkan pengukuran absorbansi dengan nanodrop spektrofotometer. Sementara itu, jaringan yang disimpan menggunakan FTA-card menghasilkan DNA dengan konsentrasi yang sangat tinggi dibandingkan hasil metode ekstraksi tersebut, namun dengan kualitas kemurnian yang rendah. DNA total hasil ekstraksi dari penyimpanan jaringan pada berbagai kondisi dan DNA dari penyimpanan dengan FTA-card ketika dijadikan template dalam PCR standar menggunakan pasangan primer P1/P7 menunjukkan bahwa tidak semua DNA fitoplasma terdeteksi positif. Namun, pengujian selanjutnya amplikon-amplikon PCR dengan primer P1/P7 tersebut sebagai template untuk nested-PCR menggunakan fU5/rU3 mampu meningkatkan detektabilitas fitoplasma yang berasal dari penyimpanan contoh pada berbagai kondisi dengan memberikan hasil positif dari contoh yang negatif pada PCR standar. Analisis nukleotida parsial gen 16S rRNA fitoplasma produk PCR standar berukuran sekitar ±850 pb dengan menggunakan PCR standar menunjukkan homologi dengan persentase tertinggi senilai 96% dengan beberapa strain yang data nukleotidanya tersimpan di GenBank NCBI. Beberapa strain fitoplasma yang terdekat adalah Sweet potato little leaf dan Peanut witches' broom phytoplasma. Cara penyimpanan jaringan tanaman yang terinfeksi fitoplasma yang optimum untuk mempertahankan kuantitas dan kualitas asam nukleat yang diekstraksi dapat dimanfaatkan dalam kegiatan penelitian dan maupun terapan yang melibatkan metode deteksi dan identifikasi menggunakan metode molekuler untuk patogen tumbuhan lain.