| dc.description.abstract | Teknologi transgenesis telah diaplikasikan untuk meningkatkan performa karakter penting organisme budidaya, diantaranya peningkatan ketahanan terhadap penyakit, kondisi lingkungan yang ekstrim, atau peningkatan kandungan produk primer. Kandungan karagenan menentukan kualitas rumput laut Kappaphycus alvarezii. Dalam rangka untuk meningkatkan kandungan kappa(κ)-karagenan pada K. alvarezii, pada penelitian ini gen penyandi enzim κ-Carrageenase (κ-Car) ditransformasi ke K. alvarezii dengan metode mediasi Agrobacterium tumefaciens. Gen penyandi enzim κ-Car berperan dalam biosintesis κ-karagenan. Gen κ-Car dibuat dengan sintesis secara in vitro berdasarkan sekuen gen κ-Car yang berasal dari Pseudoalteromonas yang telah ada di bank gen.
Penelitian ini terdiri atas 3 (tiga) tahapan utama. Penelitian tahap pertama bertujuan menghasilkan vektor kloning dan vektor ekspresi untuk proses transformasi. Sekuen gen penyandi κ-Car disisipkan dalam plasmid pMSH untuk membuat konstruksi biner pMSH/κ-Car yang dikendalikan oleh promoter 35S CaMV (35S) dan terminator Nos (tNos). Transformasi plasmid pMSH/κ-Car pada bakteri Escherichia coli dilakukan menggunakan metode heat-shock, sedangkan pada Agrobacterium tumefaciens menggunakan metode tri-parental mating. Hasil penelitian menunjukkan bahwa koloni bakteri E. coli dan A. tumefaciens transforman dapat tumbuh pada media selektif. Analisis polymerase chain reaction (PCR) dengan cetakan DNA dari koloni bakteri tersebut menggunakan primer 35S-Forward (35S-F) dan tNos-Reverse (tNos-R) menghasilkan fragmen DNA berukuran sekitar 2.000 bp, sama dengan total ukuran sekuen promoter 35S, gen κ-Car, dan tNos. Pengurutan DNA dan analisis pensejajaran menggunakan program Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) menunjukkan kesamaan sekuen (73-76%) fragmen gen κ-Car produk PCR dengan urutan nukleotida gen κ-Carrageenase yang telah diisolasi dari sumber lainnya yang ada di bank gen. Hasil ini juga menguatkan bahwa fragmen κ-Car yang ditransformasi ke vektor adalah sesuai yang diharapkan. Konstruksi pMSH/κ-Car berhasil dibuat dan telah dihasilkan koloni A. tumefaciens transforman positif membawa pMSH/κ-Car.
Penelitian tahap kedua bertujuan menghasilkan rumput laut K. alvarezii transgenik gen κ-Car. Transformasi gen κ-Car ke eksplan K. alvarezii dilakukan menggunakan metode mediasi A. tumefaciens. Pemeliharaan eksplan pascatransformasi dilakukan selama empat bulan secara steril pada botol kultur 200 mL dengan penggoyangan 100 rpm. Analisis K. alvarezii transgenik yang membawa gen κ-Car dilakukan menggunakan metode PCR dengan dua set primer. Hasil pemeliharaan eksplan pascatransformasi menunjukkan bahwa sintasan eksplan dengan perlakuan transformasi (transforman) sebesar 36%, dan kontrol (non transformasi) sebesar 92%. Jumlah eksplan yang hidup, kemudian bertunas adalah sebesar 88,9% pada transforman dan kontrol sebesar 87%, dengan ukuran panjang tunas 5-10 mm. Dua eksplan bertunas yang dianalisis PCR DNA, menunjukkan 100% membawa gen κ-Car (transgenik). Ukuran fragmen DNA
hasil amplifikasi dari K. alvarezii transgenik menggunakan primer 35S-F dan tNos-R adalah 2.000 bp, berukuran sama dengan produk PCR dari kontrol positif dengan cetakan plasmid pMSH/κ-Car. Sementara itu, tidak ada produk amplifikasi pada K. alvarezii yang tidak ditransformasi (kontrol negatif). Selanjutnya, analisis PCR menggunakan primer 35S-F dan 35S-R menunjukkan produk amplifikasi berukuran 300 bp, hal ini sama dengan ukuran sekuen promoter 35S CaMV. Dengan demikian, rumput laut K. alvarezii transgenik yang membawa κ-Car telah berhasil diproduksi.
Penelitian tahap ketiga, meliputi pemeliharaan lanjut eksplan K. alvarezii transgenik, kandidat transgenik lainnya dan non transgenik (kontrol), serta analisis ekspresi mRNA. Pemeliharaan lanjut dilakukan selama delapan bulan secara semi- steril menggunakan wadah botol kerucut volume 1500 mL yang dilengkapi sistem aerasi. Ekstraksi RNA total dari K. alvarezii transgenik dilakukan menggunakan TRIzol® Reagent dan sintesis DNA komplementer (cDNA) dilakukan menggunakan IscriptTM cDNA Synthesis Kit dengan teknik reverse transcriptase PCR (RT-PCR). Primer yang digunakan untuk gen κ-Car adalah κ-Car-F 5’-CCA CTT GCC ATT CGA CCC AAGA-3’ dan κ-Car-R 5’-CAC CAA CGA TTT CAC CGT CAA CG-3’ sedangkan primer untuk gen Actin sebagai kontrol internal adalah Actin-F 5’-CCG TCC CGA TTT ACG AGG GTTA-3’ dan Actin-R 5’-GCA TGA GGA GCT TCG CCA TCC-3’. Hasil pemeliharaan lanjut menunjukkan sintasan eksplan K. alvarezii transgenik sebesar 100%, eksplan kandidat transgenik lainnya sebesar 36%, dan kontrol sebesar 43%, dengan jumlah tunas 2-4 per eksplan dan panjang tunas 5-18 mm. Hasil analisis kuantitatif PCR pada K. alvarezii transgenik menunjukkan tingkat ekspresi gen κ-Carrageenase dinormalisasi dengan ekspresi gen Actin adalah sebesar 0,983 untuk tunas transgenik T1 dan 0,962 pada tunas transgenik T2. Dengan demikian, gen κ-Carrageenase diekspresikan pada Kappaphycus alvarezii transgenik dengan level relatif sama. | id |
