Respon Akar Terhadap Cekaman Salinitas Dan Isolasi Gen Sinac065 Pada Empat Genotipe Hotong [Setaria Italica (L.) Beauv]

Abstract

Cekaman salinitas telah mempengaruhi sekitar 19.5% lahan pertanian beririgasi di dunia dan merupakan salah satu masalah pada lahan pasang surut di Indonesia yang luasnya mencapai 20 juta ha. Foxtail millet (Setaria italica L. Beauv) atau yang dikenal sebagai hotong merupakan salah satu tanaman yang potensial dikembangkan pada lahan salin karena toleransinya yang cukup baik terhadap cekaman salinitas. Walaupun cukup toleran terhadap cekaman salinitas, taraf toleransi hotong terhadap cekaman tersebut dilaporkan bervariasi antar genotipe. Perbandingan respon antara genotipe toleran dan peka terhadap cekaman salinitas dapat mengidentifikasi karakter penting, baik morfologi, anatomi, fisiologi dan molekuler pada kondisi cekaman tersebut. Akar merupakan organ tanaman yang pertama kali terpapar cekaman pada cekaman salinitas dan modifikasi akar merupakan respon yang menentukan toleransi tanaman terhadap cekaman salinitas. Respon tanaman secara anatomi dan morfologi terhadap cekaman salinitas ditentukan oleh sejumlah gen regulator (regulatory genes) yang disebut faktor transkripsi. Faktor transkripsi dari famili gen NAC (NAM, ATAF, CUC) merupakan salah satu faktor transkripsi yang terlibat erat dalam respon terhadap cekaman salinitas dan pembentukan akar lateral melalui lintasan sinyal etilen dan auksin.Gen SiNAC065 telah diisolasi dari tanaman hotong dan ekspresinya dilaporkan terinduksi oleh cekaman salinitas dan oleh aplikasi etilen eksogen. Oleh karena itu tujuan dari penelitian ini adalah (1) mempelajari respon anatomi, morfologi dan fisiologi tanaman hotong terhadap cekaman salinitas, khususnya peran etilen dalam modifikasi karakter akar, dan (2) mengisolasi dan mengkarakterisasi gen SiNAC065 terkait respon terhadap cekaman salinitas pada genotipe hotong toleran dan peka salinitas. Penelitian ini terdiri atas 2 percobaan. Percobaan 1 terdiri atas 2 sub percobaan, yaitu percobaan 1a terkait respon anatomi akar genotipe hotong toleran dan peka terhadap cekaman salinitas, dan percobaan 1b terkait respon genotipe hotong toleran dan peka cekaman salinitas terhadap aplikasi regulator etilen eksogen. Percobaan 1 dilakukan di rumah kaca kebun percobaan Cikabayan dan Laboratorium mikroteknik AGH-IPB pada bulan Mei hingga Agustus 2015. Percobaan 1a disusun berdasarkan rancangan kelompok lengkap teracak faktorial dengan 2 faktor dan tiga ulangan. Faktor pertama merupakan genotipe hotong yang terdiri atas 2 genotipe diduga toleran (ICERI-5 dan ICERI-6) dan 2 genotipe diduga peka (ICERI-4 dan ICERI-10). Faktor kedua adalah konsentrasi NaCl yang terdiri atas 0, 60 dan 120 mM. Cekaman salinitas menyebabkan perubahan anatomi akar hotong, yaitu peningkatan tebal epidermis, tebal korteks, diameter akar, dan pertambahan jumlah rambut akar. Genotipe peka mengalami peningkatan tebal epidermis, diameter akar dan jumlah rambut akar akibat cekaman salinitas yang lebih tinggi dibandingkan genotipe toleran. Jumlah protoxylem pada genotipe toleran meningkat akibat cekaman salinitas, sebaliknya jumlah protoxylem menurun akibat cekaman salinitas pada genotipe peka. Hal tersebut menunjukkan bahwa sejumlah variabel anatomi akar mungkin menentukan taraf toleransi hotong terhadap cekaman salinitas. Percobaan 1b disusun berdasarkan rancangan kelompok lengkap teracak faktorial dengan 2 faktor. Faktor pertama merupakan konsentrasi NaCl yang terdiri atas 0 dan 60 mM. Faktor kedua adalah regulator etilen yang terdiri atas kontrol (tanpa regulator etilen), etilen eksogen (12 ppm etephon) dan inhibitor aksi etilen (0.6μM AgNO3). Hasil percobaan menunjukkan bahwa interaksi antara konsentrasi NaCl dengan regulator etilen berpengaruh terhadap tinggi tajuk, jumlah daun, bobot kering tajuk dan pada beberapa variabel anatomi akar, yaitu tebal korteks, diameter stele, diameter akar dan jumlah protoxylem. Aplikasi etilen secara eksogen pada cekaman salinitas 60 mM semakin memperparah dampak cekaman, dengan semakin terhambatnya pertumbuhan tinggi tajuk, panjang akar dan berkurangnya bobot kering tajuk. Cekaman salinitas menyebabkan peningkatan diameter akar dengan meningkatnya tebal epidermis, tebal korteks dan diameter stele, sementara itu aplikasi etilen eksogen (12 ppm etephon) dapat mempertahankan ukuran diameter akar, tebal korteks, dan diameter stele seperti kondisi kontrol. Sebaliknya, aplikasi inhibitor etilen (0.6μM AgNO3) menyebabkan peningkatan diameter akar yang signifikan pada masingmasing genotipe. Korelasi negatif nyata antara diameter akar dengan jumlah daun dan bobot basah tajuk, menunjukkan bahwa semakin besar diameter akar menyebabkan penurunan jumlah daun dan mengurangi bobot basah tajuk. Aplikasi etilen eksogen lebih menekan tinggi tajuk pada genotipe peka (ICERI-4, ICERI-10) dibandingkan pada genotipe toleran (ICERI-5 dan ICERI-6). Percobaan 1 menunjukkan bahwa respon hotong terhadap cekaman salinitas dipengaruhi oleh etilen. Gen SiNAC065 merupakan salah satu gen faktor transkripsi yang ekspresinya terinduksi oleh cekaman salinitas dan aplikasi etilen eksogen. Oleh karena itu, Percobaan 2, Isolasi gen SiNAC065 terkait respon tanaman terhadap cekaman salinitas pada hotong, dilaksanakan di Laboratorium Plant Molecular Biology, Departemen Agronomi dan Hortikultura, IPB dan Laboratory of Environmental Stress Tolerance Mechanisms, The University of Tokyo. Materi genetik yang digunakan adalah empat genotipe hotong (ICERI-4, ICERI-5, ICERI-6 dan ICERI-10). Fragmen berukuran ± 1300 pb telah teramplifikasi dari DNA genom keempat genotipe hotong menggunakan primer spesifik gen SiNAC065. Perunutan basa nukleotida menggunakan metode direct sequencing pada keempat fragmen yang teramplifikasi dan analisis kesejajaran menggunakan BLAST menunjukkan bahwa fragmen tersebut merupakan homolog gen SiNAC065. Metode direct sequencing hanya dapat membaca sebagian dari fragmen. Oleh karena itu, sub-cloning ke dalam plasmid pMD20 dilakukan agar sekuen full length dari keempat fragmen tersebut dapat diperoleh. Hasil perunutan basa nukleotida pada fragmen yang diinsersikan ke dalam pMD20 menunjukkan bahwa gen SiNAC065 yang diisolasi dari DNA genom keempat genotipe hotong berukuran 1 265 pb. Gen tersebut memiliki satu intron dan dua ekson. Gabungan antara kedua ekson merupakan coding sequence yang menyandikan 325 asam amino. Pensejajaran asam amino hasil translasi fragmen gen SiNAC065 dari empat genotipe hotong menunjukkan bahwa daerah terkonservasi gen SiNAC065 berada pada asam amino ke 19-325 dan memiliki 8 motif terkonservasi. Berdasarkan motif terkonservasinya, SiNAC065 dari genotipe ICERI-4, ICERI-5, ICERI-6, dan ICERI-10 termasuk ke dalam kelompok gen SNAC (stress responsive NACs) yang terlibat dalam respon terhadap cekaman abiotik.